原位PCR是Hasse等於1990年建立的技術，就是在組織細胞里進行PCR反應，它結合了具有細胞定位能力的原位雜交和高度特異敏感的PCR技術的優點，是細胞學科研與臨床診斷領域裡的一項有較大潛力的新技術。原位PCR既能分辨鑑定帶有靶序列的細胞，又能標出靶序列在細胞內的位置，於分子和細胞水平上研究疾病的發病機理和臨床過程及病理的轉歸有重大的實用價值。
基本介紹
組織處理的要求,套用範圍,大致過程,實驗玻片的處理,組織固定液和固定時間,基本方法,與PCR的區別,所需設備,探針種類,探針標記物種類,怎樣設定原位PCR對照實驗,原位PCR的優勢和不足,配置,
組織處理的要求
套用範圍
主要套用於兩方面：（1）檢測外源性基因片段，提高檢出率，集中在病毒感染的檢查上，如HIV、HPV、HBV、CMV等；（2）觀察病原體在體內分布規律（3）內源性基因片段，如人體的單基因病、重組基因、易位的染色體、Ig的mRNA片段、癌基因片段等。（4）檢測導入基因；（5） 遺傳病基因檢測如β－地中海貧血。
大致過程
實驗用的標本是新鮮組織、石蠟包埋組織、脫落細胞、血細胞等。其基本方法為多聚甲醛固定組織或細胞，蛋白酶消化處理組織；在組織細胞片上滴加PCR反應液進行擴增，覆蓋並加液體石蠟後，在原位PCR儀上進行PCR循環擴增，PCR擴增結束後用標記的探針進行原位雜交，最後顯微鏡觀察結果。
實驗玻片的處理
固定液的選擇標準是什麼？
保持組織結構，最大限度地保持細胞內DNA或RNA水平，使引物和探針更易於進入細胞內，在規定的時間內進行反應。
組織固定液和固定時間
固 定 劑 固 定 時 間
細 胞 組 織
甲醇/丙酮(1:1) 4min 20min
4%多聚甲醛 30min 60min
2%戊二醛 30min 60min
10%中性福馬林 overnight overnight
基本方法
②蛋白酶K消化處理：用60ug/ml的蛋白酶K將固定好的組織細胞片55℃消化處理2h後，96℃2min以滅活蛋白酶K。
⑤顯微鏡觀察結果。
與PCR的區別
PCR是提取細胞或組織中的DNA進行基因擴增反應，而原位PCR是保持細胞或組織的完整性，使PCR反應體系滲透到組織和細胞中，在細胞的靶DNA所在的位置上進行基因擴增，不但可以檢測到靶DNA，而且還可以了解靶DNA存在於何種細胞中，更有利於探討靶DNA與細胞之間的關係。
PCR所採用的反應體系能否套用於原位PCR
PCR與原位PCR所採用的反應體系中都包括Taq聚合酶緩衝液、Mg2+、K+、4×dNTP、一對特異性引物和Taq聚合酶。但是由於組織細胞間質會吸附Mg2+，所以原位PCR中採用的Mg2+濃度要比PCR的要高，採用4.5-5.5mM可以保證有足夠的Mg2+進行反應。另外由於原位PCR中的基因擴增過程中，各反應成分須經過滲透到靶DNA處才能進行擴增，所以建議將反應循環數增加到35 個。
所需設備
原位PCR反應是在載玻片的平面上進行，保持水平可以使反應各組分均勻地分布在組織切片上，所以須在原位PCR儀上進行，該儀器不但可以使載玻片保持水平，而且還可以給載玻片進行均勻地加熱，保證擴增反應的順利進行。
探針種類
探針標記物種類
常用標記物有地高辛半抗原（digaoxigenin），生物素（biotin），過氧化物酶（HRP），還可以標記一些螢光物質如異硫氰酸螢光素（FITC），花青（cyanine，Cy2，Cy3，Cy5）等。
怎樣設定原位PCR對照實驗
設立陽性對照，即用已知陽性細胞或組織切片做陽性標誌，實驗結果應呈陽性，表明實驗方法準確可靠。同時要設立陰性對照，即用已知陰性細胞或組織切片作陰性對照，實驗結果應呈陰性，表示實驗方法無假陽性結果；也可以用實驗細胞或組織切片，不加標記的dUTP（直接法），PCR結果顯示陰性，或不加引物或不加TaqDNA聚合酶等，結果均應陰性。
原位PCR中直接法和間接法有何異同
直接法：進行原位PCR擴增以前，把同位素或非同位素(常用)標記的核苷(如dig-dUTP及Biotin-dUTP)標記的底物或引物5’末端連線標記物加入PCR反應液中，隨著擴增的進行，標記的核苷或引物直接摻入到PCR產物中，然後免疫組化直接進行檢測。間接法：先進行細胞內目的DNA基因原位擴增，然後用標記的探針進行核酸分子原位雜交以定位檢測擴增的DNA的技術，步驟相對較多，需時長，但結果可靠。
獲得特異原位PCR結果需要考慮哪些關鍵因素
原位PCR技術操作包括了組織學技術、PCR技術、原位雜交技術及免疫組化學技術，因此在複雜的操作過程中，有很多因素影響實驗結果。要考慮的一些關鍵因素有待檢組織的有效固定，在PCR前的組織預處理包括酶消化使核酸有效暴露，PCR環節中要設計特異的擴增引物、Mg2+的濃度、TaqDNA聚合酶用量、反應循環參數。間接法中用原位雜交檢測時考慮探針濃度、抗體濃度和顯色時間。
原位PCR中的組織預處理和原位雜交是否相同
要獲得理想的原位PCR結果，需要將待檢組織進行預處理使核酸充分暴露，這和原位雜交組織預處理的原則相同。因此原位雜交中的組織預處理步驟如HCL和蛋白酶處理等同樣適用於原位PCR。
原位PCR的優勢和不足
PCR雖然能擴增包括福馬林固定、石蠟包埋組織的各種標本的DNA，但擴增的DNA或RNA產物不能在組織細胞中定位，因而不能直接與特定的組織細胞特徵相聯繫，這是該技術一個局限性。原位雜交雖具有良好的定位能力，但由於其敏感性問題，尤其是在石蠟切片中，尚不能檢測出低含量的DNA或RNA序列。而原位PCR可使擴增的特定DNA片段在分離細胞和組織切片中定位，從而彌補了PCR和原位雜交的不足。
兩者實驗所需試劑沒有差別，但由於組織晶片的高通量特點，比起傳統的病理切片來說，所加的試劑量要遠遠低於病理切片，勞動強度也大大降低。
配置
主機一台，個人存儲卡一張，原位PCR適配器
1.適用於96×0.2ml PCR管或77×0.5ml PCR管或8×12PCR板不需要更換模組；
2.反應槽溫控範圍：4-99℃；
3.控溫精度：±0.2℃；
4.模組均一性：≤±0.5℃；
5.溫控速率：升3℃/秒,降2℃/秒，速率可調；
6.程式數目：儀器可存100個，配單獨的個人卡，卡上可存10個，方便插入其他同類機器上直接調用預設好的程式；
7.設有斷電自動重啟選項
8. RS-232接口和印表機接口
9. 編程模式：梯度功能、可調升降溫速率、時間和溫度增幅、孵育模式、原位模式、連結功能、暫停功能；
10. 帶熱蓋，熱蓋溫度和高度可調，控溫範圍：37-110℃；
11.尺寸(長x 寬x 高) cm：26 x 41 x 27
12.重量(kg)：12.4
13.最大功率要求: 500 W
14.電源：所有型號均為230 V/50-60 Hz
