原位多聚酶鏈式反應技術

原位多聚酶鏈式反應技術,是多聚酶鏈式反應PCR)技術的一部分,後者是在體外經酶促反應將某一特定DNA序列進行高效、快速擴增,它可將單一拷貝的待測核酸以指數的形式擴增而達到常規方法可檢測的水平,但不能進行組織學定位。原位PCR(in situ PCR)技術是將PCR的高效擴增與原位雜交的細胞及組織學定位相結合,在冷凍或石蠟包埋組織切片,細胞塗片或培養細胞爬片上來檢測和定位核算的技術。

方法,套用,缺陷,

方法

原位PCR技術有直接法原位PCR,間接法原位PCR,原位反轉錄PCR和原位再生式序列複製反應等方法,其中套用較為廣泛的是間接原位PCR方法,其主要程式有組織固定,預處理,原位擴增及擴增產物的原位雜交和檢測等。由於使用原位雜交技術對擴增產物作檢測,使間接法的特異性較直接法高。

套用

1,用於低拷貝的內源性基因的檢測和定位,在完整的細胞樣本上能檢測出單一拷貝的DNA序列,可用於基因突變,基因重排和染色體易位等的研究和觀察。
2,用於外源性基因的檢測和定位,如對各種感染性疾病病原的基因檢測,如EB病毒、人乳頭狀瘤病毒、肝炎病毒、巨細胞病毒和人免疫缺陷病毒基因組及結核、麻風桿菌基因的檢測等。
3,臨床上還可用於對接受了基因治療患者體內導入基因的檢測等。

缺陷

①特異性不高,特別是假陽性的問題。可能產生假陽性的原因有引物擴增序列的彌散等。提高其檢測結果的特異性,必須設計嚴格的實驗對照,包括已知陽性和陰性對照,引物對照,PCR反應體系對照和用DNA酶和RNA酶處理後樣本的陰性對照等;
②技術操作複雜,影響因素太多;
③需要特殊的設備,即原位PCR儀,多為進口,價格昂貴,加之技術方法上存在的問題等,短時間內還難於在國內大面積推廣使用,但有一定的潛在套用前景。

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