《創新黴素生物合成途徑的闡釋和異源表達》是依託山東大學，由卞小瑩擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：創新黴素生物合成途徑的闡釋和異源表達
- 項目類別：青年科學基金項目
- 項目負責人：卞小瑩
- 依託單位：山東大學
中文摘要,結題摘要,
中文摘要
創新黴素是中國發現的第一個全新結構的抗生素，對於大腸桿菌引起的敗血症、膽囊炎和尿路感染等疾病有顯著的療效。創新黴素識別的靶標獨特(細菌色氨醯tRNA合成酶)，且結構新穎，但生物合成機制還未闡明。前期工作對創新黴素產生菌-濟南遊動放線菌-進行了全基因組測序(預計2015年5月完成)，本項目擬對其基因組序列進行生物信息學分析，對可能的創新黴素生物合成基因簇進行大片段直接克隆，導入合適異源宿主細胞進行表達，鑑定基因簇的完整性；進而通過對關鍵基因進行失活、基因回補、體外酶反應以闡明創新黴素分子中硫的生源途徑和吲哚並噻喃三環的合成機制；最後通過組合生物合成等手段產生新的衍生物用於進一步的藥效評價。本項目有助於闡釋創新黴素中稀有的含硫雜環體系的生物合成機制，也為將來的藥物開發提供重要的基因資源。
結題摘要
創新黴素是由中國科學家發現的第一個全新結構的抗生素，含有獨特的吲哚駢噻喃三環結構，是細菌色氨醯tRNA合成酶的抑制劑，臨床試驗顯示對大腸桿菌引起的敗血症、膽囊炎和尿路感染具有一定的治療效果。為了發掘創新黴素作為先導化合物的潛力，本項目利用異源表達結合基因敲除探究創新黴素的生物合成途徑和調控機理。首先對創新黴素產生菌濟南遊動放線菌進行全基因組測序，通過掃描抗性基因-色氨醯tRNA合成酶的方法，定位創新黴素基因簇Cxm0-9，包含轉錄調控因子Cxm1，轉運蛋白Cxm2，硫載體蛋白Cxm4參與S原子的滲入，P450單加氧酶Cxm5和還原酶Cxm6負責噻喃環形成，甲基轉移酶Cxm8和Cxm9負責甲基化。由於本源菌難以操作，將cxm0-9直接克隆到大腸桿菌載體上，並轉入三個鏈黴菌異源宿主中，均能產生創新黴素，及甲基創新黴素和新化合物4，說明該基因簇負責創新黴素生物合成。進一步試驗確定Cxm1是正轉錄調控因子；VB12依賴自由基SAM蛋白Cxm8和假定蛋白Cxm9共同負責C-3的甲基化，這是首次發現兩個酶共同催化單個甲基化；Cxm34在異源宿主能夠產生化合物4，說明負責S原子滲入；Cxm3456能夠產生去甲基創新黴素，說明Cxm56與S-雜環的形成相關，因此確定了負責獨特吲哚駢噻喃三環結構的四個酶Cxm3456。我們還對酶功能進行生化實驗驗證，成功表達並純化得到功能蛋白Cxm34567。生化實驗證實Cxm7催化色氨酸形成吲哚丙酮酸，起始創新黴素生物合成。其它酶的生化試驗仍在探索中。本研究確定了創新黴素的生物合成基因簇，提出了生物合成途徑，為體外闡明吲哚駢噻喃三環結構的生物合成和體內組合生物合成產生新衍生物奠定了基礎。 項目資助發表論文5篇，其中SCI論文4篇；申請發明專利一項。培養研究生三名，其中一名已經取得博士學位，兩名碩士生在讀。
