大腸桿菌混合碳源利用中木糖轉運瓶頸的解除機制研究

《大腸桿菌混合碳源利用中木糖轉運瓶頸的解除機制研究》是依託浙江大學，由葉麗丹擔任項目負責人的青年科學基金項目。

基本介紹

• 中文名：大腸桿菌混合碳源利用中木糖轉運瓶頸的解除機制研究
• 依託單位：浙江大學
• 項目負責人：葉麗丹
• 項目類別：青年科學基金項目

項目摘要

葡萄糖和木糖是木質纖維素水解液的主要成分，葡萄糖-木糖混合碳源的有效共利用對高效轉化生物質製備化工產品具有重要意義。然而，目前大多數微生物，包括工業上常用的大腸桿菌，對葡萄糖-木糖混合碳源的利用效率較低，其中一個重要原因是木糖轉運造成的瓶頸。為了探討木糖轉運瓶頸的解除機制，本項目計畫從兩個方面進行研究：首先利用全局調控因子Mlc對磷酸轉移酶系統進行轉錄水平調控，解除碳分解代謝物阻遏效應對木糖轉運造成的抑制；然後對來源於凝結芽孢桿菌的木糖轉運蛋白進行異源表達，增強大腸桿菌的木糖轉運能力。同時，為了揭示木糖轉運瓶頸的解除對於混合碳源發酵的影響，本項目將以異戊二烯作為模式產物，探究大腸桿菌工程菌株高效轉化葡萄糖-木糖混合碳源生產大宗化工產品的能力，從而進一步理解造成木糖轉運瓶頸的原因及解除機制。葡萄糖-木糖混合碳源利用中木糖轉運瓶頸解除機制的闡釋將為實現生物質的高效轉化提供堅實的理論基礎。

結題摘要

異戊二烯作為合成化學工業的基礎原料，被廣泛套用於合成橡膠、醫藥、香料和農藥等領域，其巨大的市場和傳統化學法的原料瓶頸導致其生物合成受到越來越廣泛的關注。而木質纖維素廣泛存在於自然界中，是一種豐富的可再生資源，可以為化學品的生物合成提供可持續性的原材料。本研究圍繞生物質基異戊二烯的異源合成，開展了一系列探索性的研究。一方面在底盤細胞中構建和最佳化異戊二烯生物合成途徑；另一方面針對木質纖維素原料的有效利用，進行木糖轉運和糖代謝改造。 首先以大腸桿菌為底盤生物，成功構建了異戊二烯生產菌株，並通過對MEP途徑關鍵酶進行改造以及對上下游途徑進行平衡調控，成功地使異戊二烯產量提高了4.7倍。期間考慮到木質纖維素原料在水解過程中除了釋放葡萄糖、木糖等單糖，還會產生乙酸、糠醛等有害副產物，而大腸桿菌對這些物質的耐受性遠不如釀酒酵母；並且大腸桿菌的異源途徑表達往往需要添加IPTG等誘導劑，在成本方面對於異戊二烯等大宗化學品的生產不利，因此將底盤細胞換成釀酒酵母進行研究。為了構建能夠利用木糖高效合成異戊二烯的釀酒酵母菌株，本研究一方面圍繞異戊二烯合成途徑和關鍵酶開展代謝調控和蛋白質改造，大幅提升異戊二烯產量，由mg/L水平提高到g/L水平；一方面通過表達外源木糖異構酶和對相關途徑基因進行表達調控，並在此基礎上探索對木糖轉運蛋白進行分子改造的方法，提高菌株對木糖的利用效率，初步實現釀酒酵母利用木糖作為碳源合成異戊二烯的代謝途徑。在研究過程中，還開發了適用於釀酒酵母的途徑組裝工具盒和多位點敲除系統，設計了新型的高通量篩選方法用於途徑關鍵酶的分子改造，提出並驗證了蛋白質改造和代謝調控相結合的綜合調控策略。 通過本項目的研究，顯著提高了底盤生物大腸桿菌和釀酒酵母的異戊二烯合成能力，初步構建了能夠利用木糖產異戊二烯的釀酒酵母菌株，為利用生物質原料生產異戊二烯奠定了初步的研究基礎，並且為其他萜烯類天然產物的異源合成及其調控提供了借鑑。