《分子改造β-半乳糖苷酶拓寬轉糖基受體選擇性》是依託山東大學，由盧麗麗擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：分子改造β-半乳糖苷酶拓寬轉糖基受體選擇性
- 項目類別：青年科學基金項目
- 項目負責人：盧麗麗
- 依託單位：山東大學
中文摘要,結題摘要,
中文摘要
β-半乳糖苷酶是一類重要的糖苷酶，能對多種受體分子糖環或烷基上的羥基進行糖基化，合成具有重要價值的半乳糖苷化合物，但該類酶不能糖基化芳香環羥基，轉糖基受體種類存在一定局限，限制了其合成糖苷的種類及其在某些藥物修飾等方面的套用。本項目通過蛋白質理性設計和非理性設計分子改造β-半乳糖苷酶，拓寬轉糖基受體選擇性，拓展酶的套用範圍。擬採用生物信息學方法預測酶與受體選擇性相關的胺基酸位點，驗證推測結果，確定關鍵位點；在關鍵位點採用PCR進行點飽和突變，同時對酶基因採用易錯PCR和連續易錯PCR進行隨機突變，以簡單酚類為受體快速篩選並獲得受體選擇性拓寬的突變酶；套用突變酶糖基化重要化合物的芳香環羥基獲得糖苷新產物，如糖基化修飾酚類化合物及雜環類藥物分子如鏈黑黴素等。本項目將填補國際上糖苷酶與受體選擇性相關位點研究及分子改造糖苷酶拓寬受體選擇性的空白，並推進糖苷庫、糖基化工程和糖藥物的研究與產品開發。
結題摘要
本項目按計畫完成預計目標：確定了保加利亞乳桿菌L3β-半乳糖苷酶與受體選擇性相關的關鍵胺基酸位點；獲得了2種受體選擇性拓寬的突變酶；用突變酶修飾重要化合物的芳香環羥基、獲得了5種以上糖苷新產物；發表了2篇SCI論文（Food Chem, 2012, 134: 269-275；Bioresource Technol, 2012, 116:327-333）；超額申請了6項國家發明專利（專利申請號：201310256401.9, 201310255797.5, 201310257383.6, 201310257340.8, 201310256580.6, 201310257432.6）。預測並驗證了β-半乳糖苷酶與底物特異性相關的胺基酸位點——W980位點，在該位點進行點飽和突變研究，所得19種突變酶對人工底物鄰硝基苯半乳糖苷的水解活性降低。以19種突變酶粗細胞酶液為酶源，以乳糖為底物進行自轉糖基反應，結果顯示所有突變酶對乳糖的水解及自轉糖基的活性均降低，然而，當以乳糖為糖基供體、以對苯二酚為糖基受體時，突變酶W980F對對苯二酚的轉糖基產物產量明顯提高。進一步純化獲得W980F突變酶純酶，該純化酶對鄰硝基苯半乳糖苷的Km值相比於原始酶降低，對乳糖的Km值增加，其他酶學性質與原始酶基本一致。突變酶對醇羥基受體的轉糖基性質與原始酶基本一致，但對酚羥基受體的轉糖基能力較原始酶顯著提高。同時採用易錯PCR對原始酶進行隨機突變，通過X-Gal平板初篩及轉糖基反應TLC復篩獲得一株突變酶252具有新的轉苷受體選擇性，能對白藜蘆醇進行糖基化。對該突變酶基因進行測序和序列分析，結果表明該突變酶6個胺基酸位點發生突變，分別為Q40R、K85R、F117S、D433G、V511A、E707G，選擇以上6個胺基酸位點進行單點突變，結果表明117、511、707位的單點突變也能使該酶獲得對白藜蘆醇的轉苷能力，這些位點也與該酶的轉糖基受體選擇性相關。套用上述兩種突變酶以苯酚、鄰苯二酚、間苯三酚、咖啡酸、白藜蘆醇為受體進行轉糖基反應，所獲得的轉糖基產物經製備TLC及Bio-gel P2柱層析分離純化後，採用質譜分析分子量，然後通過一維和二維核磁共振（氫譜、碳譜、HSQC，HMBC）確定為新的半乳糖苷產物，順利完成了本項目的預期目標。
