p53在中華絨螯蟹生精細胞凋亡過程中作用的分子機制

《p53在中華絨螯蟹生精細胞凋亡過程中作用的分子機制》是依託浙江大學，由楊萬喜擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：p53在中華絨螯蟹生精細胞凋亡過程中作用的分子機制
• 依託單位：浙江大學
• 項目負責人：楊萬喜
• 項目類別：面上項目

項目摘要

中華絨螯蟹是我國重要的經濟甲殼動物之一，在正常情況下，一定數量功能性精子的形成對該物質的繁殖至關重要。生精細胞凋亡是控制精子質量的重要途徑之一，但目前動物精子質量下降是普遍問題，原因未知。儘管p53被證明通過參與自發性和誘導性細胞凋亡調控精子發生過程，但迄今大多數對該調控機制研究僅限於哺乳動物。p53是否及如何參與和調控中華絨螯蟹生精細胞的凋亡至今無人問津。本課題組已經從中華絨螯蟹精巢中克隆出p53基因，並對其mRNA表達和分布做了初步研究。在現有結果基礎上，我們認為p53可能會通過內源性或者外源性細胞凋亡路徑參與中華絨螯蟹生精細胞的凋亡過程，p53蛋白的泛素化調控可能和p53調節正常的精子發生及生精細胞凋亡密切相關。本項目擬用基因克隆、原位雜交、定量PCR、免疫共沉澱、免疫螢光、免疫電鏡、TUNEL、Annexin V等研究技術驗證上述假設，其結果將揭示中華絨螯蟹生精細胞凋亡的可能機制。

結題摘要

動物精子發生過程中生精細胞的凋亡機制一直是學術界關注的問題。甲殼動物成熟的精子被包裹在精莢中，成熟的精子被傳送到精莢之前發生了怎樣的生精細胞篩選過程我們並不知曉。甲殼動物的精子發生是否通過凋亡來調控精子的形成是我們關心的問題。本項的目的旨在部分揭示這一機制。近些年來，環境中的重金屬鎘(Cadmium, Cd)造成的污染嚴重影響了人類的生殖健康。水環境中鎘污染這一環境壓力是否會誘導中華絨螯蟹生精細胞凋亡以及p53是否會在凋亡過程中發揮作用是我們感興趣的問題。我們的研究假設是: p53可能通過內源性或者外源性細胞凋亡路徑參與中華絨螯蟹生精細胞的凋亡過程。經過四年的努力，我們基本完成了項目的預期目標。我們成功地克隆出p53基因、caspase 3基因、caspase 7基因、caspase 8基因的全長，並通過對胺基酸序列的分析，鑑定出了p53蛋白、Caspase 3蛋白、Caspase 7蛋白、Caspase 8蛋白的結構功能域，p53蛋白保守的結構域預測該蛋白可能作為泛素化底物參與精子發生中凋亡過程；半定量PCR檢測了p53基因、caspase 3基因、caspase 7基因、caspase 8基因在不同組織中表達量的變化，證實在精巢中p53基因、caspase 3基因、caspase 7基因、caspase 8基因的存在。探索了p53基因、caspase 3基因、caspase 7基因、caspase 8基因在精子形成過程中的空間分布，其分布特徵暗示了p53基因、caspase 3基因、caspase 7基因、caspase 8基因與精子發生有相關性；p53蛋白、Caspase 3蛋白、Caspase 7蛋白、Caspase 8蛋白多克隆抗體成功製備；確認了Caspase 3蛋白在組織中的存在，為後續進一步揭示我們的科學問題即p53通過內外源凋亡途徑參與中華絨螯蟹精子發生凋亡過程奠定基礎。與此同時，成功地克隆出日本蟳phb基因的全長，並通過對胺基酸序列的分析，鑑定出了日本蟳PHB蛋白的結構功能域；通過免疫印跡實驗證實在日本蟳精巢中存在PHB蛋白，其保守的結構域預測該蛋白可能作為泛素化底物參與日本蟳精子發生中線粒體泛素化過程，這為探究甲殼類精子發生過程中細胞凋亡機制奠定基礎。