《泛素蛋白酶體途徑在中華絨螯蟹精子頂體反應中的功能》是依託華東師範大學，由何琳擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：泛素蛋白酶體途徑在中華絨螯蟹精子頂體反應中的功能
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：何琳
- 依託單位：華東師範大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
模式生物中已經證實泛素蛋白酶體途徑（UPS）在頂體反應和精卵融合過程中具有的重要作用。泛素化調節決定精子膜蛋白、頂體反應和精卵相互作用過程中關鍵蛋白的活性，因此關注泛素蛋白酶體途徑在中華絨螯蟹生殖中的作用對我們進一步理解河蟹生殖機制具有重要意義。河蟹精子多精著卵、單精受精，以及體內著精、體外受精和群體生殖洄游的特點，使其成為研究生殖的最佳模型。基於河蟹精巢和副性腺轉錄組數據，從中發現291個泛素蛋白和49個蛋白酶體亞基基因，為全面了解生殖相關泛素蛋白酶體途徑提供了基礎數據，利用完善的泛素研究體系研究河蟹精子頂體反應和精卵相互作用過程中泛素蛋白酶體調節方式，重點關注精子受體蛋白、精子頭粒蛋白、精子頂體蛋白、受精素、Prohibitin等在精子中通過員厚灑UPS調控實現功能調節的蛋白，利用UPS途徑專一性抑制劑處理精子分析上述蛋白在精卵相互作用過程中的功能，為闡明UPS在河蟹生殖中的功能積累分子證據
結題摘要
泛素蛋白酶體途徑（UPS）在附睪內精子成熟、頂體反應和精卵融合過程中具有的重要作用。泛素化調節決定精子膜蛋白、頂體反應和精卵相互作用過程中關鍵蛋白的活性戲拘，因此關注泛素蛋白酶體途徑在中華絨螯蟹生殖中的作用對我們進一步理解河蟹生殖機制具有重要意義。在本項目資助下我們全面分析泛素蛋白酶體途徑關鍵作用因子在中華絨蟹生殖相關組織中的分布特徵，結合基因組和轉錄組數據分廈葛遙析，採用分子克隆、精巢組織細胞培養、組織學分析、螢光定量PCR、蛋白印跡、免疫印跡等多種分子學手段對中華絨螯蟹Cullin基因進行以下六個方面的研究: (1)通過H&E染色並顯微鏡下觀察中華絨螯蟹精子發生不同時期的形態學並根據生殖細胞在生精小管占的優勢比例將其進行分類；(2)成功構建中華絨螯蟹精巢組織細胞體外培養平台，觀察精子形成的形態學變化；(3)本課題結合中華絨螯蟹的精巢轉錄組 (~2.31 Gb) 和基因組 (~ 439.3 Gb)，發現Cullin家族在中華絨螯蟹一共存在5個Cullin基因，分別是Cul1、熱櫃樂幾Cul2、Cul3、Cul4 和Cul5，並獲得cDNA全長進行組織表達模式、分子進化及保守性分析；(4) 進一步探究Cullin4如何調控中華絨螯蟹的精子發生過程，以增愚旋蘭殖細胞核抗原 PCNA為內源性蛋白分子Marker來研究Cullin參與調控中華絨螯蟹的精子發生。研究發現Cul4 與 P53、PCNA及其底物蛋白(P21、P27)在精巢發育不同時期的表達趨勢一致，即在精母細胞期(八月)表達量最高，隨著精子發育成熟而降低。 我們體外培養精巢組織細胞，然後通過添加NAE 酶抑制劑MLN4924來觀察底物蛋白P21，P27蛋白的積累情況。同時研究了抑癌基因 P53、及研究已經證實的以Cul4為支架蛋白的CRLs泛素連線酶E3的特異性識別底物即細胞周期負調控因子P21和P27與Cul4的表達差異。我們通過添加濃度為1 μM/L NAE酶抑制劑MLN4924，發現細胞周期負調控因子P21在整乘蒸付細胞培養36-48小時後，P27蛋白在24-36小時過程中都有較大程度的積累，相比對照組DMSO。 P53通過誘導不能修復的受損的生殖細胞凋亡來自發控制精子質量。P21、P27作為CRL4的底物蛋白隨後會相應地被泛素化蛋白酶體途徑降解，從而維持細胞周期的動態平衡。由此證明Cul4參與調控河蟹精子巴旬乎質量控制。
