《中華絨螯蟹精子膜蛋白組成及其修飾機理的研究》是依託華東師範大學，由王群擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：中華絨螯蟹精子膜蛋白組成及其修飾機理的研究
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：王群
- 依託單位：華東師範大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
精子膜蛋白修飾是精子成熟、獲能、完成頂體反應並最終完成受精過程的重要環節和保障。本項目採用蛋白質串聯質譜（LC-MS/MS）技術，結合生物信息學分析，較全面地了解中華絨螯蟹精子膜蛋白的組成結構以及在受精中的功能特點；採用i-TRAQ多重化學標記串聯質譜技術，系統分析不同生殖道蛋白對精子膜蛋白的修飾作用，確定精子膜蛋白被修飾的種類、修飾的方式以及這些被修飾蛋白在生殖過程中的生理功能；採用Pull-Down或免疫共沉澱等技術，找出修飾精子膜蛋白的作用蛋白，確定這些作用蛋白的來源及功能；根據質譜分析所獲得的胺基酸序列，克隆重要功能蛋白基因，研究這些基因的結構以及在不同發育期的表達模式。綜合上述研究結果，全面分析中華絨螯蟹精子膜蛋白的修飾機理以及生殖道蛋白在受精過程中的作用，初步闡明該蟹雄性生殖的分子機制，為該蟹人工養殖業的發展提供堅實的理論支撐。
結題摘要
通過比較TM-PEK試劑盒法和TritonX-114液相分離法發現，TM-PEK試劑盒法效率要高於TritonX-114液相分離法。利用TM-PEK試劑盒法抽提獲得精子膜蛋白，經質譜鑑定共識別765個非冗餘蛋白，369個有GO注釋，其中181個注釋蛋白是膜蛋白。使用TMHMM 2.0 algorithm識別出109個至少含有一個跨膜結構域的蛋白。使用ExPASy的ProtParam工具分析蛋白的GRAVY值，GRAVY值的範圍是−3.114至1.127，其中129個蛋白為正值。由於中華絨螯蟹精子膜蛋白的提取存在一定的困難，不同方法獲得的精子膜蛋白均有一定的局限性，因此還需進一步探討精子膜蛋白的提取方法。 結合轉錄組，通過設計兼併引物克隆及western blot等實驗結果發現在中華絨螯蟹中僅存在一個Cul4亞型，Cul4在精巢發育的早期表達量相對較高，且主要表達在精母細胞的胞質中；通過全基因組分析證實，中華絨螯蟹Cullin家族一共存在5個亞型，其中Cul1, Cul3和 Cul4在雄性生殖腺組織表達量較高，並隨著精子發育成熟而降低，同時發現Cul4與P53、PCNA及其底物蛋白(P21、P27)在精巢發育不同時期的表達趨勢一致；通過添加NAE酶抑制劑MLN4924證實，Cul4參與了類泛素化修飾，調控細胞周期進程，從而影響精子發生過程。此外，通過基因的表達分析、免疫螢光、免疫組化、western blot以及免疫共沉澱等方法，初步證明：Es-DDX6參與了中華絨螯蟹精巢和卵巢組織的發育，並且主要參與了卵母細胞生長過程；Es-ADAM10和Es-ADAM17可能參與了中華絨螯蟹精母細胞的凋亡過程，以調控精子質量；Esserpin-3在精子發育和成熟過程中發揮重要功能，推測Esserpin-3可能以與HongrES1和Protein CInhibitor相同的方式作為一種去獲能因子參與調控中華絨螯蟹頂體反應；在中華絨螯蟹卵巢發育成熟時期，FOXL2一方面與DDX20相結合調控卵母細胞周圍濾泡細胞的凋亡，從而阻止卵母細胞通過濾泡細胞從血淋巴中吸取VTG；另一方面，FOXL2與FTZ-F1相結合可能參與調控類固醇激素合成過程中P450芳香化酶的表達，從而調控類固醇激素的合成，最後通過阻止類固醇激素的合成來抑制類固醇激素促進脂肪體釋放VTG。
