《中華絨螯蟹副性腺相關功能蛋白和基因的研究》是依託華東師範大學，由王群擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：中華絨螯蟹副性腺相關功能蛋白和基因的研究
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：王群
- 依託單位：華東師範大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
副性腺對動物的生殖具有重要作用，而副性腺蛋白則明顯影響著精子的功能狀態和受精能力。因此，副性腺功能的研究對深入闡述動物的生殖機理具有重要的意義。本項目以中華絨鰲蟹為研究對象，採用蛋白質分離純化、2-D蛋白質電泳、蛋白質質譜等方法和手段 ，通過逐級分離、鑑定以及蛋白質差異分析，獲得相關功能蛋白，確定蛋白的特性及部分胺基酸序列；同時，通過構建副性腺不同發育期差減基因表達文庫，獲得副性腺不同發育期的差異表達基因，採用生物信息學的方法，結合哺乳動物已有研究成果，確定副性腺中與生殖相關的功能基因。結合上述研究，利用已知蛋白序列和基因序列，設計特異引物，分析這些功能基因在組織中的時空表達規律，探討這些基因的功能及其作用機制。通過上述的研究，以期深入了解副性腺在中華絨螯蟹生殖中的作用，為全面闡述中華絨螯蟹的生殖機理以及該蟹的生殖營養調控和人工繁殖等提供重要理論參考。
結題摘要
利用抑制性差減雜交技術(SSH)和2DE蛋白質電泳及質譜技術，完成了副性腺發育早期和快速發育期的差減cDNA文庫構建，獲得170餘條高質量ESTs序列，並對與頂體反應中鈣離子釋放密切相關的基因TCTP進行克隆和表達分析，以及其他生殖相關基因，如泛素途徑相關的SUMO-1、Ubc9以及另外兩個 ubiquitinribosomal fusion protein基因分別進行克隆和功能分析，逐步闡明中華絨螯蟹生殖相關的泛素化調節途經。另外通過對副性腺組織的cDNA構建獲得了副性腺發育高峰期與生殖相關的很多重要功能基因，並對這些基因逐一進行全長克隆和功能研究，包括leptin receptor、Es-FABP9、Es-FABP、cathepsin A、cathepsin C、cathepsin L、Selenoprotein M、macrophage migration inhibitory protein (MIF)、caspase and nm23等等，分別對這些基因的表達水平和其他物種該基因的同源比對建立系統進化分析，在中華絨螯蟹中開展了大量的基礎研究工作，為生殖機理的闡明提供了大量候選基因。 另外，我們在該項目資助下首次發現中華絨螯蟹副性腺分泌蛋白可以破裂精莢釋放活性完好的游離精子。本研究通過不同溫度和副性腺蛋白濃度的二因子正交試驗，以完全消化精莢所需時間為依據，研究了副性腺蛋白消化精莢從而獲得游離精子的最佳反應條件（32℃，15.4 mg/ml），進一步分析發現副性腺蛋白濃度是影響精莢消化的主要因子。與此同時，比較了副性腺蛋白消化法、胰蛋白酶消化法和機械勻漿法所獲游離精子的死亡率，結果發現副性腺蛋白消化法得到的精子死亡率最低（1.94±0.29﹪）而頂體酶活力最高，機械勻漿法得到的精子死亡率最高（22.28±0.48﹪）而頂體酶活力最低，三者間均存在顯著性差異（P＜0.05）。 在上述研究結果的基礎上，我們進一步採用親和柱層晰方法對副性腺內容物組分進行純化並分析各組分消化精莢的效果，確定具有最高消化精莢活性的組分利用SDS-PAGE方法分離以後進行Shot-gun質譜鑑定分離獲得起到關鍵消化作用的蛋白成份為Cathepsin A蛋白，進而確認該蛋白在副性腺分泌蛋白中的含量，初步闡明中華絨螯蟹副性腺對精莢破裂過程的作用方式。
