《基於vasa基因的中華絨螯蟹早期性別分化機制研究》是依託蘇州大學，由吳萍擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：基於vasa基因的中華絨螯蟹早期性別分化機制研究
- 項目類別：青年科學基金項目
- 項目負責人：吳萍
- 依託單位：蘇州大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
我們已經發現在中華絨螯蟹(河蟹)中存在偽雄蟹的特例，表明其性別分化可能會受到外界環境因子或自身生理因素的干擾。本項目擬立足在生殖腺中特異表達的vasa基因,研究河蟹性別分化的機制。通過同源克隆、RACE等技術獲得河蟹vasa基因cDNA全序列；進一步以vasa作為分子標記，通過原位雜交、免疫組化等技術揭示河蟹原始生殖細胞發生、遷移、分化及性腺形成的規律；採用嗎啉修飾的反義寡核苷酸敲降技術抑制胚胎髮育過程中vasa基因的表達，初步探明河蟹vasa基因的功能，闡明河蟹早期性別分化的機制。在此基礎上，通過環境內分泌干擾物及溫度對河蟹胚胎髮育的人工干預，獲得環境因子影響河蟹性別的證據，確定明顯提高單性比例的溫度可控點，從而擬定可套用於生產實踐的人工調控河蟹性別分化的策略，為其今後有望進行的單性化養殖奠定基礎。
結題摘要
為了研究中華絨螯蟹性別分化的機制，本研究首先套用連續石蠟切片法研究了中華絨螯蟹性腺開始分化的時間節點，發現在溞狀幼體Ⅳ期時，原始生殖細胞已開始遷移至背主動脈腹面進行定居；至大眼幼體期出現雌雄性腺的原型。接著，採用RACE技術克隆並獲得了vasa基因cDNA全序列。中華絨螯蟹vasa cDNA全長2162bp，共編碼560個aa，蛋白質分子量61.9KD，含有DEAD-box家族的9個結構域和GG重複序列，在性腺中特異性表達。為了了解中華絨螯蟹vasa的功能，分別選取了胚胎髮育中5個時期、溞狀幼體各期及大眼幼體期，檢測了vasa基因在此發育過程中的表達。發現vasa的表達在胚胎髮育階段要高於後續的幼體發育階段，在心跳期達到峰值，表明vasa 的作用主要體現在胚胎階段。原位雜交結果表明，vasa在各級生精細胞中表達，在次級精母細胞中主要分布於染色質中，而在精細胞中則主要分布於核杯中，在卵細胞中主要分布於細胞質中。進一步以vasa基因作為分子標記在河蟹幼體發育中示蹤生殖腺的形成。最初的生殖腺原基為胚胎膜內的一物質團，至心跳期已比較明顯，溞狀幼體Ⅰ期時分布於頭胸甲與腹部交接處，位於顎足的下方，隨著發育逐漸向上方遷移，至溞狀幼體Ⅱ期時已完全遷移至頭胸甲，溞狀幼體Ⅲ期已有生殖腺的雛形，至大眼幼體時已完全形成。 與vasa同為DEAD-box家族的PL10基因是vasa基因的祖先，vasa mRNA和nanos mRNA是性腺的最初成分P 顆粒中的2個最重要的組成成分，另一基因piwi能造成vasa基因的轉錄沉默。本研究克隆了中華絨螯蟹PL10、nanos和piwi 3個基因，分別研究了這3個基因在中華絨螯蟹精巢、卵巢各發育時期的表達模式，在胚胎和幼體發育階段的表達模式。採用原位雜交研究了piwi和nanos在卵巢和精巢中的定位，將其作為分子標記示蹤了生殖腺的形成。在胚胎髮育各期及溞狀幼體階段，vasa和nanos的表達模式相似，說明在生殖腺形成過程中兩者功能相近。通過轉錄組測序和分析，研究了中華絨螯蟹在轉錄組水平的性別分化差異。發現精巢和卵巢在KEGG路徑中前25個含序列最多的代謝通路、與生殖相關的基因種類和豐度上均存在差異。經對轉錄組測序數據的SSR和SNP分析，獲得了8061個微衛星序列，11566個SNP，研究結果為後續性別差異的SSR和SNP分子標記篩選打下了基礎。
