kank1在鼻咽癌中失活機制與功能研究

《kank1在鼻咽癌中失活機制與功能研究》是依託中南大學，由湯參娥擔任項目負責人的青年科學基金項目。

基本介紹

• 中文名：kank1在鼻咽癌中失活機制與功能研究
• 項目類別：青年科學基金項目
• 項目負責人：湯參娥
• 依託單位：中南大學

項目摘要

經全基因組掃描和比較基因組雜交發現，kank1基因位於鼻咽癌LOH的熱點區域9p24.3.本立項將通過Real-time RT-PCR和Western-blot篩查kank1在人鼻咽癌組織中表達情況，結合LOH和MSP方法檢測相應DNA拷貝數及啟動子區甲基化的異常，分析kank1基因在鼻咽癌中表達下調/缺失的機制。建立穩定表達kank1的鼻咽癌細胞系、表達下調的NP69細胞和裸鼠移植瘤模型，分析kank1表達改變後細胞系生物學特徵、裸鼠成瘤性和EMT標誌物的改變，闡明kank1基因的抑瘤功能。再以建立的細胞係為樣本，分析kank1表達下調/缺失是否通過上調PI3K和Wnt-β-catenin信號通路活性而導致NPC的侵襲轉移。本項目不僅有助於闡明kank1基因抑瘤作用的分子機理，而且能為鼻咽癌的發病與防治提供新思路，具有重要的理論和實際意義。

結題摘要

鼻咽癌是具有顯著地域分布差異特性的與遺傳、EB病毒感染和環境因素有關的一種上皮源性惡性腫瘤。遺傳因素特別是瘤基因的激活和抑瘤基因的失活在鼻咽癌發病中具有十分重要的作用。kank1基因位於鼻咽癌染色體高頻率缺失區域9p24.3。提示kank1與鼻咽癌可能相關。本項目檢測kank1在鼻咽癌細胞系和組織中的表達情況。結果顯示，kank1轉錄本在正常鼻咽細胞系NP69和幾乎全部非癌組織均有表達，而在4株鼻咽癌細胞系和大於50%的鼻咽癌組織中表達下調或缺失。kank1蛋白在60%（12/20）的鼻咽癌組織中表達下調。結果表明，鼻咽癌中kank1基因存在高頻率的表達下調/缺失。 採用PCR-變性聚丙烯醯胺凝膠電泳-銀染方法，分析kank1基因上下游的D9S1858和WI-12779二個微衛星位點在鼻咽癌組織中的雜合性缺失情況。結果顯示，該位點發生LOH的頻率分別為31.4%(11/35)和34.3%(12/35)，kank1基因LOH的頻率為51.4%(18/35)；鼻咽癌細胞株和鼻咽癌組織中kank1基因全部出現甲基化位點，而正常組織中甲基化頻率為60%（6/10）。提示kank1等位基因LOH和啟動子高甲基化可能是導致其在鼻咽癌中表達下調/缺失的重要原因。採用不同濃度的去甲基化藥物處理細胞，能部分恢復kank1 的表達並繼續影響細胞的生長和凋亡。 採用脂質體轉染技術建立kank1高表達的5-8F鼻咽癌細胞系。MTT分析結果顯示，轉染組細胞的增殖速度明顯低於對照組；軟瓊脂集落形成實驗的結果顯示轉染組細胞的克隆形成率低於對照組；流式細胞術分析的結果顯示，轉染組細胞Go/G1期細胞比例明顯增加，S期和G2/M期細胞比例明顯減少；流式細胞術和Hoechst 33258染色結果顯示，轉染組細胞的凋亡明顯高於對照組細胞；細胞體外遷移和侵襲實驗顯示，轉染組細胞的運動能力和侵襲能力均明顯降低。研究結果提示，kank1具有抑制鼻咽癌細胞增殖、促進鼻咽癌細胞凋亡以及抑制鼻咽癌細胞體外遷移和侵襲的作用。 採用免疫組化（IHC）染色檢測kank1在組織中的表達。結果顯示，kank1在72.5%(50/69)的鼻咽癌組織中表達下調，而在14例正常鼻咽黏膜上皮中只有1例表達下調。kank1表達下調/缺失與鼻咽癌淋巴結轉移和臨床分期負相關。