Epigenetics

Epigenetics（表觀遺傳學）是遺傳學分支學科，主要研究基因的核苷酸序列不發生改變的情況下，基因表達的可遺傳的變化。

基本介紹

• 中文名：表觀遺傳學
• 外文名：Epigenetics
• 提出：Waddingtong
• 主要研究：基因表達的可遺傳的變化
• 學術類型：遺傳學分支學科

Epigenetics

表觀遺傳學

WHAT IS EPIGENETICS

In biology, and specifically genetics, epigenetics is the study of inherited changes in phenotype (appearance) or gene expression caused by mechanisms other than changes in the underlying DNA sequence, hence the name epi- (Greek: επί- over, above) -genetics. These changes may remain through cell divisions for the remainder of the cell's life and may also last for multiple generations. However, there is no change in the underlying DNA sequence of the organism; instead, non-genetic factors cause the organism's genes to behave (or "express themselves") differently.

The best example of epigenetic changes in eukaryotic biology is the process of cellular differentiation. During morphogenesis, totipotent stem cells become the various pluripotent cell lines of the embryo which in turn become fully differentiated cells. In other words, a single fertilized egg cell – the zygote – changes into the many cell types including neurons, muscle cells, epithelium, blood vessels etc. as it continues to divide. It does so by activating some genes while inhibiting others.[3]

表觀遺傳學(Epigenetics)之DNA甲基化

DNA甲基化是表觀遺傳學(Epigenetics)的重要組成部分，在維持正常細胞功能、遺傳印記、胚胎髮育以及人類腫瘤發生中起著重要作用，是目前新的研究熱點之一。隨著對甲基化研究的不斷深入，各種各樣甲基化檢測方法被開發出來以滿足不同類型研究的要求。這些方法概括起來可分為三類：基因組整體水平的甲基化檢測、基因特異位點甲基化的檢測和新甲基化位點的尋找。

近15年來，人們越來越認識到DNA甲基化研究的重要性，開發出一系列檢測DNA的方法。根據研究目的這些方法分為：基因組整體水平的甲基化檢測，特異位點甲基化的檢測和新甲基化位點的尋找。根據研究所用處理方法不同可以分為：基於PCR的甲基化分析方法；基於限制性內切酶的甲基化分析方法；基於重亞硫酸鹽的甲基化分析方法和柱層法等。

DNA甲基化的分析方法很多，可分為總基因組甲基化的檢測和單基因序列特異性甲基化分析的研究。總基因組甲基化的檢測又分為全基因組序列特異性甲基化分析和基因組非特異性甲基化水平的研究。前者包括甲基化差異性雜交顯示、寡核苷酸微陣列法和基因組限制性酶切掃描法；後者包括3H—SAM摻人後液閃檢測法和高壓液相色譜法。

對單基因序列特異性甲基化分析包括傳統的甲基化敏感的限制性內切酶分析、比較簡潔的甲基化特異性PCR、全面反映甲基化情況的亞硫酸氫鈉變性後測序、甲基化敏感性單核苷酸引物擴增、較新穎的甲基化螢光檢測、結合亞硫酸氫鈉變性的限制性酶分析、酶的區域性甲基化特異性分析和變性高壓液相色譜法。

甲基化敏感的單核苷酸的擴增(Ms—SnuPE)

Ms—SnuPE即甲基化特異的單核苷酸擴增，它能對不同甲基化特異位點進行快速定量，是一種快速估計特異性CpG位點甲基化不同情況的定量方法。

先用重亞硫酸鹽處理基因組DNA，未甲基化的胞嘧啶全部轉化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變。進行PCR擴增，然後取等量擴增產物置於2管中，分別作為Ms—SnuPE單核苷酸引物延伸的模板。設計用於Ms—SnuPE延伸的引物的3’端緊鄰待測鹼基。同時於2個反應體系中加入等量的Taq酶、引物、同位素標記的dCTP或dTTP。這樣，如果待測位點被甲基化，則同位素標記的dCTP會在反應延伸時連於引物末端；若是未被甲基化，則標記的dTTP參與反應。末端延伸產物經電泳分離和放射活性測定後可得出C/T值，即為甲基化與非甲基化的比值，從而分析得到待測片段中CpG位點甲基化情況。

甲基化敏感限制性內切酶(MSRE)法

MSRE是一類對其識別位點含有甲基化鹼基敏感的限制性內切酶，目前至少已發現320種。此類酶如在其切割位點中含有一個甲基化鹼基，則它們中的絕大多數就不能切割DNA。MSRE法是基於甲基化敏感Ⅱ型限制性內切酶不能切割含有一個或多個甲基化切點序列的基本原理。用甲基敏感Ⅱ型內切酶及其同工酶(對甲基化不敏感)切割含有一個或多個甲基化CpG序列的片段，然後用DNA印跡法分析。此法的最大優點就是無須知道靶DNA一級結構的詳細信息，並可提供CpG島甲基化狀態的直接評價，包括取得一些對被檢基因甲基化的定量分析信息。但該法除了需要大量的高相對分子質量DNA(≥5ug)外，還只能檢測到拷貝數比例大於百分之幾的甲基化等位基因，並且僅能提供MSRE識別序列中那些CpG島甲基化狀態的信息。

甲基化螢光PCR檢測

甲基化螢光檢測(methylight)是利用螢光定量性PCR檢測亞硫酸氫鈉處理後的序列改變。在TaqManR技術中，可以使用3種不同的單核苷酸(正義引物、反義引物和螢光雜交探針)，進行不同序列的檢測。與已存在的技術相比，甲基化螢光檢測最明顯的優點就是能同時對幾百甚至幾千例樣品迅速檢測。

高敏感、快速是本方法最顯著的特點，它可以在非甲基化等位基因超出10 000倍的情況下精確地檢測到甲基化的等位基因並定量，而且可以做多樣本、多基因位點的快速分析。此外，該方法具備可重複、所需樣本量少、不需要電泳分離的特點，可以為臨床標本的分子生物學研究提供可靠的技術支持。缺點是費用高，測定每個位點都要用兩端標有螢光素的探針和一對引物，且受較多因素影響。

結合亞硫酸氫鈉處理和酶解分析(COBRA)

亞硫酸氫鈉處理的DNA擴增後使甲基化的胞嘧啶殘基成為胸腺嘧啶，而已經甲基化的胞嘧啶殘基仍維持胞嘧啶。這種變化會產生新的酶切位點或保持原有的甲基化依賴位點。PCR反應的引物中不包含CpG二核苷酸，因此與模板和原來的甲基化位點不會混淆。在此之後，將PCR產物純化、酶切、聚丙烯醯胺凝膠電泳、電印跡、單核苷酸雜交和磷圖像定量。

COBRA是一個測定DNA甲基化敏感的定量方法，在檢測完全甲基化和完全不甲基化的樣品時最常用。在甲基化變異細胞占少數的混雜的樣品中，由於所用鏈特異性PCR不是特異擴增變異靶序列，故靈敏度較MSP差。

酶的區域性甲基化特異性分析(ERMA)

酶的區域性甲基化分析是一種定量區域性CpG甲基化密度研究方法。基因組DNA在亞硫酸氫鈉處理後，感興趣的區域由包含dam位點的引物擴增。擴增後的PCR產物與14C標記的SAM及dam甲基轉移酶溫育，作為標準DNA定量的內參照。之後將3H標記的SAM和M．SssI甲基轉移酶溫育。在每個檢測中使用具有確定甲基化位點細胞系DNA的標準混合物，每個樣品的3H/14C比值轉化為所測序列的甲基化密度百分比。該方法不能確定單獨CpG位點的甲基化狀況。

亞硫酸氫鈉測序法

直接測序法是建立在MSP基礎上進一步深入研究CpG島各個位點甲基化情況的方法。重亞硫酸鹽使DNA中未發生甲基化的胞嘧啶脫氨基轉變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變，行PCR擴增(引物設計時儘量避免有CpG，以免受甲基化因素的影響)所需片段，則尿嘧啶全部轉化成胸腺嘧啶。最後，對PCR產物進行測序，並且與未經處理的序列比較，判斷是否CpG位點發生甲基化。此方法一種可靠性及精確度很高的方法，能明確目的片段中每一個CpG位點的甲基化狀態。在尋找有意義的關鍵性CpG位點上，有其他方法無法比擬的優點。測序法以CpG島兩側不含CpG點的一段序列為引物配對區，所以能夠同時擴增出甲基化和非甲基化靶序列。它的不足是耗費時間和耗資過多，至少要測序10個以上的克隆才能獲得可靠數據，需要大量的克隆及質粒提取測序，過程較為繁瑣、昂貴。