c-Abl調控U2AF65介導的mRNA剪接及核質轉運機制研究

《c-Abl調控U2AF65介導的mRNA剪接及核質轉運機制研究》是依託中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院，由李曉明擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：c-Abl調控U2AF65介導的mRNA剪接及核質轉運機制研究
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：李曉明
• 依託單位：中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院

中文摘要

RNA成熟加工是真核生物基因表達調控中的重要環節，mRNA剪接則直接影響了相應基因的編碼信息。pre-mRNA剪接由巨大的剪接體完成。剪接體由5種細胞核糖核蛋白小體和100多種非snRNP蛋白組成。U2AF是U2 snRNP結合到pre-mRNA分支位點所必需的輔助因子，它由U2AF65和U2AF35兩個亞基組成.U2AF65是參與mRNA剪接及mRNA核質轉運的必需因子.c-Abl是重要的Src家族非受體酪氨酸激酶,具有多種生物功能。目前有報導c-Abl還能夠調節mRNA剪接相關因子。我們的研究發現c-Abl可以與U2AF65的UHM結構域結合併使其磷酸化，當細胞受到電離輻射處理後，U2AF65的核質間轉移是c-Abl依賴的。本課題將系統研究c-Abl酪氨酸激酶與U2AF65的相互作用，研究c-Abl介導的U2AF65磷酸化，並闡釋其調控mRNA剪接、mRNA核質轉運的分子機制。

結題摘要

本項目系統研究了非受體酪氨酸激酶c-Abl與剪接因子U2AF65相互作用，c-Abl 介導U2AF65磷酸化，c-Abl調節U2AF65的核質穿梭和mRNA轉運的機制，c-Abl參與調控轉錄和前體mRNA可變剪接以及其通過U2AF65介導的剪接調控的機制。項目研究總體按照既定的實施計畫，稍作調整和變動，取得了預期的研究結果。項目研究得到如下關鍵結果：證明c-Abl和U2AF65在細胞內外直接相互作用，並且c-Abl通過SH2、SH3結構域與U2AF65直接結合。發現U2AF65與c-Abl結合的結構域是UHM結構域，參與結合的胺基酸殘基主要包括第414、416和423位脯氨酸。證明c-Abl使U2AF65酪氨酸發生磷酸化，但是磷酸化程度較弱；質譜分析發現其可能的磷酸化位點是第91位和第232位酪氨酸。進一步發現c-Abl基本不影響U2AF65的表達。U2AF65是核質穿梭蛋白，但通常在螢光顯微鏡下只在細胞核中被觀察到。發現在電離輻射導致的DNA損傷應激條件下，U2AF65由細胞核向細胞質轉移，轉移程度具有劑量依賴性；隨著時間的推移，U2AF65又由細胞質向細胞核轉位。以c-Abl特異性抑制劑STI571處理細胞，無論是出核還是之後的入核都被抑制。在缺失c-Abl激酶活性的MCF-7細胞系中發現U2AF65更多地定位在細胞質，以15Gy劑量的電離輻射處理之後，也沒有發生核質間轉移，說明U2AF65在細胞內的分布和c-Abl的活性相關。由此證明c-Abl調控電離輻射介導的U2AF65的核質間的穿梭。實驗證明U2AF65蛋白自身可能含有NES信號。之後分析發現U2AF65可能的NES的特徵性序列LCLMNMVLP。通過瞬間異核體形成實驗證明U2AF65的NES介導其出核。同時發現，電離輻射可調控U2AF65介導的mRNA轉運，在細胞接受電離輻射不同時間後，細胞質中U2AF65介導的HEXIM和ZNF174基因mRNA水平均升高。通過Affymetrix外顯子晶片和RNA-Seq分析發現c-Abl廣泛參與的轉錄和剪接調控，U2AF65參與剪接調控。尤其是電離輻射誘導的DNA損傷修復通路的剪接調控。部分數據得到RT-PCR實驗驗證。本項目的原創性研究對深入認識c-Abl在生理和應激條件下的基因轉錄、mRNA前體剪接、出核轉運等調控功能具有重要意義。