Total RNA:總RNA,從組織中提取純化所得的RNA,包含了細胞中的全部RNA,用來區別僅包含mRNA的RNA純化。
TRIzol法提取Total RNA
準備以下滅菌材料:
1xPBS、TRIzol、1.5mlEP管、氯仿、異丙醇、75%乙醇(DEPC處理)、DEPC處理過的水、1xTE、RNase-free槍頭。
1.用槍吸取細胞培養液,後用1xPBS洗一次。
2.加入1ml TRIzol,用槍反覆吹吸至溶液不再粘稠,將溶液轉移至1.5mlEP管中。
3.常溫(15℃~30℃)靜置5min,讓核蛋白複合體充分裂解。
4.加入270ul氯仿,劇烈振盪15s,常溫(15℃~30℃)靜置15min。
5.離心4℃,12000rpm,15min。
6.小心吸取上層水相400ul~500ul至一新的離心管中(過程中不要吸到或用槍頭碰到位於水相和有機相間的蛋白沉澱),加入670ul異丙醇,常溫(15℃~30℃)靜置10min。
7.離心4℃,12000rpm,10min。
8.棄上清,用800ul 75%乙醇洗沉澱,混勻後離心,4℃,7500rpm,5min。
9.用槍頭小心吸盡上清,靜置5min~10min至殘餘乙醇揮發盡。(不可完全乾燥RNA,因這樣將顯著降低其溶解度。)
10.加入30ul~50ul DEPC處理過的水(RNase-free water),用手指輕彈使其溶解。
11.取2ul RNA樣品,溶解在98ul 1xTE中,測濃度(1xTE做空白對照,A260/280=2.0)。確保其濃度達到1.0ug/ul~1.4ug/ul。後取RNA樣品,跑1%瓊脂糖凝膠,檢測Total RNA提取情況。
12.提取出來的Total RNA先進行分裝,後保存在-80℃冰櫃待用。