small RNA測序是生命活動重要的調控因子，在基因表達調控、生物個體發育、代謝及疾病的發生等生理過程中起著重要的作用。Illumina能夠對細胞或者組織中的全部Small RNA進行深度測序及定量分析等研究。
原理簡介,詳細內容,
原理簡介
Small RNA（micro RNAs、siRNAs和 pi RNAs等）是生命活動重要的調控因子，在基因表達調控、生物個體發育、代謝及疾病的發生等生理過程中起著重要的作用。Illumina能夠對細胞或者組織中的全部Small RNA進行深度測序及定量分析等研究。實驗時首先將18-30 nt範圍的Small RNA從總RNA中分離出來，兩端分別加上特定接頭後體外反轉錄做成cDNA再做進一步處理後，利用測序儀對DNA片段進行單向末端直接測序。通過Illumina對Small RNA大規模測序分析，可以從中獲得物種全基因組水平的miRNA圖譜，實現包括新miRNA分子的挖掘，其作用靶基因的預測和鑑定、樣品間差異表達分析、miRNAs聚類和表達譜分析等科學套用。
詳細內容
Small RNA是一大類調控分子，幾乎存在於所有的生物體中。Small RNA包括：miRNA、ncRNA、siRNA、snoRNA、piRNA、rasiRNA等等。Small RNA通過多種多樣的作用途徑，包括mRNA降解、翻譯抑制、異染色質形成以及DNA去除，來調控生物體的生長發育和疾病發生。Small RNA轉錄組測序是鑑定和定量解析small RNA的新方法和有力工具。
Roche GS FLX Titanium 、Illumina Solexa GA IIx和AB SOLID 4均可以對Small RNA進行大規模測序分析， Illumina Solexa GA IIx 和ABI Solid的讀長正好配合了small RNA的短序列且通量大，可以得到更高的覆蓋率， Illumina Solexa GA IIx在small RNA測序中廣泛套用。
通過對Small RNA大規模測序分析，可以從中獲得物種全基因組水平的Small RNA圖譜，實現包括新Small RNA分子的挖掘，其作用靶基因的預測和鑑定、樣品間差異表達分析、Small RNA聚類和表達譜分析等科學套用。
一、small RNA測序樣品要求
(1) 樣品純度要求： OD值應在1.8至2.2之間；電泳檢測28S:18S至少大於1.5。
(2) 樣品濃度： total RNA濃度不低於750 ng/μg；提取總RNA時請不要使用過柱法提取總RNA，樣品總量不低於40 μg (Small RNA: total RNA大於0.3%)。或提供濃度大於2 ng/μg，總量大於180 ng的Small RNA樣品。
(3) Small RNA樣品請置於-20℃保存；請提供Small RNA樣品具體濃度、體積、製備時間、溶劑名稱及物種來源。請同時附上QC數據，包括電泳膠圖、分光光度或Nanodrop儀器檢測數據。如需進行多次樣品製備，需要提供多次樣品製備所需樣品。
(4) 樣品運輸：樣品請置於1.5 ml管中，管上註明樣品名稱、濃度以及製備時間，管口使用Parafilm封口。建議使用乾冰運輸，並且儘量選用較快的郵遞方式，以降低運輸過程中樣品降解的可能性。
二、Small RNA分離的方法
現行的RNA純化方法包括有機溶劑抽提+乙醇沉澱，或者是採用更加方便快捷的矽膠膜離心柱的方法來純化RNA。由於矽膠膜離心柱通常只富集較大分子的RNA(200 nt以上)，Small RNA往往被淘汰掉，因而不適用於Small RNA的分離純化。有機溶劑抽提能夠較好的保留Small RNA，但是後繼的沉澱步驟比較費時費力。目前還有另外一些Small RNA分離專用的試劑盒。如MirVana miRNA Isolation Kit是採用玻璃纖維濾膜離心柱(glass fiber filter，GFF)，既能夠富集10 mer以上的RNA分子，又兼備離心柱快速離心純化的特點。
對於Small RNA測序，我們採用PAGE膠電泳對小RNA進行分離。客戶可以選擇他們感興趣的Small RNA長度進行研究。Small RNA的長度為18-30nt。我們推薦的測序長度為35bp，之後對序列信息進行修剪，去除接頭序列僅留下Small RNA序列。
三、Small RNA測序文庫的構建方法及質量控制
由於Solexa的讀長足夠滿足Small RNA測序的讀長要求，且數據讀取量大，性價比高，因此Solexa在Small RNA測序方面得到廣泛的套用。採用Solexa進行Small RNA測序其文庫構建方法如下：
(1) PAGE膠純化特定大小的小RNA分子；
(2) 5′接頭連線和純化；
(3) 3′接頭連線純化；
(4) RT-PCR擴增；
(5) Small RNA文庫的純化；
(6) 文庫的檢測。Small RNA文庫需要通過電泳檢測和Agilent Technoligies 2100 分析儀檢測以分析測序文庫中片段的大小、純度和濃度。
四、高通量測序研究sRNA 優勢
目前研究Small RNA的方法主要是通過實時定量PCR以及基因晶片技術，這些方法主要關注microRNA的表達和定量，並僅局限與研究那些序列信息或二級莖環結構信息已知的Small RNA，無法尋找和發現新的Small RNA分子。基於高通量測序技術的Small RNA測序技術突破了目前研究技術手段上的局限性，使研究人員能夠直接對樣本中的Small RNA進行高通量測序，其主要優勢有：
(1) 可以直接從核苷酸水平上研究Small RNA分子，不存在傳統晶片雜交的螢光模擬信號帶來的交叉反應和背景噪音問題，非常利於區分相同家族以及序列極為相似的不同Small RNA分子；
(2) 可以對任意物種進行高通量分析，無需任何預先的序列信息以及二級結構信息【中國測序論壇】；
(3) 靈敏度高，測序通量大，為Small RNA分子的發現和研究提供了極大的數據深度與覆蓋率，能夠檢測豐度極低的稀有轉錄；
(4) 測序產生的原始數據可以與多種分析軟體兼容，可以注釋Small RNA的基因組信息，並分析其表達水平，能夠隨時使用公用Small RNA資料庫注釋已知的Small RNA，還可以進一步分析未匹配的數據，發現新的Small RNA種類及異構體，尋找更深入的研究信息。
五、Small RNA測序的影響因素
(1) 客戶提供樣本的質量，進行Small RNA測序過程中，需要對Small RNA進行分離，分離Small RNA的質量和純度直接影響測序結果。由於RNA容易降解，因此RNA的抽提、純化等操作一定要嚴格按照實驗要求進行，以保證樣品的質量。
(2) 構建文庫的質量：文庫構建需要PAGE膠分離純化Small RNA，然後連線接頭進行純化後才能進行RT-PCR，在此過程中，要小心操作保證Small RNA無降解，同時純化過程要保證接頭去除乾淨，殘餘的接頭會對後續的測序產生影響。
(3) 測序文庫的上樣量控制：這個因素也會很大程度影響簇生成的密度，由於上樣量非常小，只有1-8 pg，所以能否準確定量微量樣品也成為影響測序通量的重要因素。
