基本介紹
- 中文名:體外轉錄
- 前提:基因組全長克隆過程
- 性質:T7啟動子作為體外轉錄啟動子
- 第一步:提取cDNA質粒
轉錄條件,操作步驟,
轉錄條件
轉錄模板必須滿足:
1. 在基因組全長克隆過程中,在正向引物5/ 端添加T7啟動子序列;
2. 以T7啟動子作為體外轉錄啟動子,在啟動子後面靶位序列連續帶有3個G,轉錄效率最 高;
3. 在正向引物5/端添加一個帽子G,有利於提高體外轉錄RNA分子的侵染活性。
操作步驟
1. 提取cDNA質粒;
2. 線性化質粒:(利用單一的酶切位點線性化有利於轉錄)
3. 純化質粒:(儘量避免RNase污染) ① 加等體積的Tris-苯酚:氯仿(1:1)到100μL限制內切酶消化體系,渦旋振盪20s, 13000g離心5min; ②上清轉移,加入2倍體積無水乙醇和1/10體積的3M的醋酸鈉(pH5.2),-20℃放置不少於2h或過夜放置; ③DNA質粒13000g離心5min ,並且用20μL H2O重懸,放於-20℃。
4. 體外轉錄:(根據以下組成配製反應液,輕輕混勻)
10*basal reaction buffer
2μL 5*accelerator solution
4μL 25mM rNTPs mixture
4.5μL RNase Inhibitor
0.5μL Template DNA
100ng-1μg Thermo T7 RNA polymerase
1μL Nuclease-free water
up to 20μL Total volume 20μL
5. 在37℃-42℃下放置2小時。
6. 轉錄產物可通過1%非變性瓊脂糖來檢測:取產物1μL,160V電壓,結果應為兩條帶, 上為DNA模板,下為RNA 產物。
注意: 1. 模板DNA(環狀或線型):必須具有T7啟動子位點。同時,模板應為RNase-free級。在 質粒提取過程中如使用了RNase,必須通過苯酚·氯仿處理等方法除去RNase。