T4-DNA連線酶

T4-DNA連線酶即T4 DNA連線酶,可以催化粘端或平端雙鏈DNA或RNA的5’-P末端和3’-OH末端之間以磷酸二酯鍵結合,該催化反應需ATP作為輔助因子

T4 DNA Ligase即T4 DNA連線酶,可以催化粘端或平端雙鏈DNA或RNA的5’-P末端和3’-OH末端之間以磷酸二酯鍵結合,該催化反應需ATP作為輔助因子。同時T4 DNA連線酶可以修補雙鏈DNA、雙鏈RNA或DNA/RNA雜合物上的單鏈缺口(single-strand nicks)。T4DNA連線酶在分子生物學中有廣泛的套用。T4DNA連線酶是經原核表達,柱層析純化獲得的高純T4DNA接酶,SDS-PAGE顯示為一條62kD的蛋白條帶。本品附帶10xLigationBuffer含有ATP。適用於DNA片斷接、克隆等各種反應。
連線條件:
推薦在10~20μl反應體系中進行接反應,反應中DNA濃度最大可達1mM(1kbDNA約1mg/ml)。首先混合要接的DNA片段,加入10× Ligase Buffer至終濃度為1×,再加入適量T4 DNA Ligase混勻。最適連線溫度為16℃。粘末端連線效率較高,加入0.2~1μl T4 DNA Ligase,可在室溫或16℃反應1~3小時完成反應;平末端連線效率較低,加入1μl T4 DNA Ligase,通常需要在16℃或4℃過夜完成反應。
注意事項:
1)10×LigaseBuffer含有ATP,使用前應在室溫放置至融化或用手掌溫度輔助融化,然後置於冰上。不要加熱融化以免ATP降解。
2)T4 DNA Ligase對熱敏感,容易失活。使用時請放置冰上,用後立即置冰櫃中冷凍保存。
3)如需在接反應後滅活T4 DNA Ligase,可於65℃孵育10min即可。
4)10×LigaseBuffer不宜反覆凍融,建議分裝。

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