小干擾RNA

小干擾RNA（Small interfering RNA；siRNA）有時稱為短干擾RNA（short interfering RNA）或沉默RNA（silencing RNA），是一個長20到25個核苷酸的雙股RNA，在生物學上有許多不同的用途。目前已知siRNA主要參與RNA干擾（RNAi）現象，以帶有專一性的方式調節基因的表達。此外，也參與一些與RNAi相關的反應途徑，例如抗病毒機制或是染色質結構的改變。不過這些複雜機制的反應途徑目前尚未明了。

基本介紹

• 中文名：小干擾RNA
• 外文名：Small interfering RNA
• 簡寫：siRNA
• 別稱：短干擾RNA

簡介

小干擾RNA（siRNA），有時稱為短干擾RNA或沉默RNA，是一類雙鏈RNA分子，長度為20-25個鹼基對，類似於miRNA，並且在RNA干擾（RNAi）途徑內操作。它干擾了表達與互補的核苷酸序列的特定基因的轉錄後降解的mRNA，從而防止翻譯。

發現

siRNA最早是由英國的大衛·包孔博（David Baulcombe）團隊發現，是植物中的轉錄後基因沉默（post-transcriptional gene silencing；PTGS）現象的一部分，其研究結果發表於《科學》。2001年，湯瑪士·塗許爾（Thomas Tuschl）團隊發現合成的siRNA，可誘導哺乳動物體內的RNAi作用，結果發表於《科學》。這項發現引發了利用可控制的RNAi，來進行生物醫學研究與藥物開發的方法。

經由siRNA傳達的RNA干擾機制

結構

siRNA具有明確定義的結構：具有磷酸化5'末端的短（通常20至24bp）雙鏈RNA（dsRNA）和具有兩個突出核苷酸的羥基化3'末端。該切酶酶催化生產的siRNA由長的dsRNA和小髮夾RNA。siRNA也可以通過轉染引入細胞。由於原則上任何基因都可以被具有互補序列的合成siRNA敲低，因此siRNA是在後基因組時代驗證基因功能和藥物靶向的重要工具。

siRNA通常是一段長21個核苷酸的雙股RNA（dsRNA），其兩股分別在RNA的兩端超出另一端2個核苷酸，圖示如下：

每一股各有一個5'磷酸基末端與一個3'羥基末端。此結構是利用一種稱為dicer的酶處理而得，這種酶可以將較長的雙股RNA或小髮夾RNA（small hairpin RNA）切成siRNA。此外，siRNA也可經由多種不同轉染（transfection）技術導入細胞內，並對特定基因產生具專一性的敲弱（knockdown）效果。因此可利用經過適當剪裁的siRNA之互補性，來對已知序列的基因進行標定，這種現象使siRNA成為研究基因功能與藥物目標的一項重要工具。

siRNA機制

1.長dsRNA（可來自髮夾，互補RNA和RNA依賴性RNA聚合酶）被稱為Dicer的內切核糖核酸酶切割。Dicer切割長dsRNA以形成短干擾RNA或siRNA;這使得分子能夠形成RNA誘導的沉默複合物（RISC）。

2.一旦siRNA進入細胞，它就會被整合到其他蛋白質中以形成RISC。

3.一旦siRNA是RISC複合物的一部分，siRNA就展開以形成單鏈siRNA。

4.由於其在5'末端的鹼基配對而在熱力學上較不穩定的鏈被選擇作為RISC複合物的一部分。

5.作為RISC複合物一部分的單鏈siRNA現在可以掃描並找到互補的mRNA

6.一旦單鏈siRNA（RISC複合物的一部分）與其靶mRNA結合，它就會誘導mRNA切割。

7.現在切割mRNA並被細胞識別為異常。這導致mRNA的降解，並且反過來不將mRNA翻譯成胺基酸然後轉化為蛋白質。從而沉默編碼該mRNA的基因。

siRNA也類似於miRNA，然而，miRNA來自較短的莖環RNA產物，通常通過抑制翻譯來沉默基因，並且具有更廣泛的作用特異性，而siRNA通常通過在翻譯前切割mRNA而起作用，並且具有100%的互補性，因此目標特異性非常嚴格。

使用siRNA或其生物合成前體進行RNAi誘導

通過轉染外源siRNA進行的基因敲低通常是不令人滿意的，因為該效應僅是短暫的，特別是在快速分裂的細胞中。這可以通過產生siRNA的表達載體來克服。修飾siRNA序列以在兩條鏈之間引入短環。得到的轉錄物是短髮夾RNA（shRNA），其可以通過Dicer以其通常的方式加工成功能性siRNA。典型的轉錄盒使用RNA聚合酶III啟動子（例如，U6或H1）來指導小核RNA（snRNA）的轉錄（U6參與基因剪接; H1是RNase）人RNase P）的成分。理論上，所得的siRNA轉錄物然後由Dicer處理。

通過使用細胞擠壓也可以提高基因敲低效率。

RNAi中siRNA的活性很大程度上取決於其與RNA誘導的沉默複合物（RISC）的結合能力。雙鏈體siRNA與RISC的結合之後是用內切核酸酶解開和切割有義鏈。然後剩餘的反義鏈-RISC複合物可以與靶mRNA結合以啟動轉錄沉默。

RNA激活

已經發現dsRNA還可以激活基因表達，這種機制被稱為“小RNA誘導的基因激活”或RNAa。已經顯示靶向基因啟動子的dsRNA誘導相關基因的有效轉錄激活。使用合成的dsRNA在人細胞中證明RNAa，稱為“小活化RNA”（saRNA）。目前尚不清楚RNAa是否在其他生物體中是保守的。

轉錄後基因沉默

siRNA誘導的轉錄後基因沉默始於RNA誘導的沉默複合物（RISC）的組裝。該複合物通過切割編碼靶基因的mRNA分子來沉默某些基因表達。為了開始該過程，兩條siRNA鏈中的一條（引導鏈）將被裝載到RISC中，而另一條鏈即過客鏈被降解。某些Dicer酶可能負責將引導鏈載入到RISC中。然後，siRNA掃描並指導RISC到mRNA分子上完全互補的序列。認為mRNA分子的切割由RISC的Argonaute蛋白的Piwi結構域催化。然後通過切割與siRNA殘基10和11配對的靶核苷酸之間的磷酸二酯鍵精確切割mRNA分子，從5'端開始計數。這種切割導致mRNA片段被細胞核酸外切酶進一步降解。5'片段通過外來體從其3'末端降解，而3'片段從其5'末端通過5'-3'外切核糖核酸酶1（XRN1）降解。切割後靶mRNA鏈與RISC的解離允許更多的mRNA被沉默。這種解離過程很可能是由ATP水解驅動的外在因素促進的。

有時不會發生靶mRNA分子的切割。在一些情況下，磷酸二酯骨架的核酸內切裂解可以通過切割位點附近的siRNA和靶mRNA的錯配來抑制。其他時候，即使靶mRNA和siRNA完全配對，RISC的Argonaute蛋白也缺乏內切核酸酶活性。在這種情況下，基因表達將被miRNA誘導機制沉默。

Ping-Pong方法的簡化版本，涉及蛋白質Aubergine（Aub）和Argonaute-3（Ago3）切割piRNA的3'和5'末端。

Piwi相互作用的RNA負責轉座子的沉默，而不是siRNAs。

挑戰：避免非特異性影響

因為RNAi與許多其他途徑相交，所以偶爾通過實驗性引入siRNA觸發非特異性作用也就不足為奇了。當哺乳動物細胞遇到諸如siRNA的雙鏈RNA時，它可能將其誤認為是病毒副產物並產生免疫應答。此外，由於結構相關的微小RNA主要通過與靶mRNA的不完全互補鹼基對相互作用調節基因表達，因此siRNA的引入可能導致非預期的脫靶。

先天免疫

由於先天免疫應答的激活，引入過多的siRNA可導致非特異性事件。迄今為止的大多數證據表明，這可能是由於dsRNA感測器PKR的激活，儘管也可能涉及視黃酸誘導基因I（RIG-I）。還描述了通過toll樣受體7（TLR7）誘導細胞因子。減少非特異性作用的一種有希望的方法是將siRNA轉化為microRNA。微小RNA天然存在，並且通過利用該內源途徑，應該可以在相對低濃度的所得siRNA中實現類似的基因敲低。這應該最小化非特異性影響。

偏離目標

脫靶是使用siRNA作為基因敲低工具的另一個挑戰。在這裡，具有不完全互補性的基因被siRNA無意中下調（實際上，siRNA充當miRNA），導致數據解釋和潛在毒性的問題。然而，這可以通過設計適當的對照實驗來部分地解決，並且目前正在開發siRNA設計算法以產生不具有脫靶的siRNA。然後可以使用例如通過微陣列技術的全基因組表達分析來驗證這一點並進一步改進算法。來自Khvorova博士實驗室的2006年論文涉及siRNA中與位置2向前的6或7個鹼基對長的延伸，與脫靶基因中的3'UTR區域匹配。

適應性免疫反應

純RNA可能是較差的免疫原，但很容易產生針對RNA-蛋白複合物的抗體。許多自身免疫疾病都會看到這些類型的抗體。目前還沒有關於針對蛋白質結合的siRNA的抗體的報導。用於siRNA遞送的一些方法使聚乙二醇（PEG）與寡核苷酸鄰接，從而減少排泄並改善循環半衰期。然而，最近由於對RNA的PEG部分的嚴重過敏反應，Regado Biosciences不得不停止針對因子IX的聚乙二醇化RNA適體的大型III期試驗。該反應在某些情況下導致死亡，並且當涉及PEG化寡核苷酸時引起對siRNA遞送的顯著關注。