可特異性地導致mRNA的降解，特異性地抑制mRNA的翻譯，所用的mRNA可以來自體內或體外。
RNA沉默機制及其介導的植物抗病毒基因工程研究進展
基本介紹
- 中文名：RNA介導的基因沉默
- 外文名：RNA-mediated Gene Silencing
- 正文：可特異性地導致mRNA的降解
- 摘要：RNA沉默是一種由雙鏈RNA誘
- 免疫系統：事實上。一些細胞能夠識別非必
可特異性地導致mRNA的降解，特異性地抑制mRNA的翻譯，所用的mRNA可以來自體內或體外。
RNA沉默機制及其介導的植物抗病毒基因工程研究進展
摘要：RNA沉默是一種由雙鏈RNA誘導同源RNA降解的現象，是植物的一種天然抗病毒機制。但是由於長
期的共進化過程，一些病毒會在siRNA沉默途徑以及miRNA沉默途徑中編碼一些抑制蛋白來對抗這種機制，
使其作用受到抑制。文章對RNA沉默的發現、過程、抑制及其由RNA沉默介導的對RNA病毒、DNA病毒的抗
性、以及由轉病毒基因介導的病毒抗性等幾種植物抗病機制。同時，對研究中所存在的一些問題作了分析，並
RNA沉默被認為是一種基於核酸的有效的免疫系統。事實上。一些細胞能夠識別非必須的入侵外源核酸．之後通過形成21-25個核苷酸長度的核酸介導這些入侵的外源核酸的降解，雖然這一過程的機制還不是很清楚。有關這一現象的一個典型的例子是Napoli十多年前在轉基因矮牽牛中所做的實驗。之後相類似的基因沉默現象在真核生物中也有報導，這其中包括有真菌和線蟲．RNA沉默的分子基礎也得到了一定的闡述⋯。RNA沉默開始於dsRNA的合成，之後這一雙鏈RNA被一種稱為Dicer的第三類RNA酶切割成21～25個核苷酸長度的小RNA。這些小RNA分子貫穿於整個RNA沉默的過程，在RNA沉默的過程中起重要作用。它們直接誘導一多組分複合物一RNA誘導沉默複合物(RISC)結合外源RNA．這些外源RNA具有同源性。RISC總是包含一些Ago蛋白家族成員，像人類中的A902蛋白【引，在RISC中表現出內切酶活性。RNA沉默的第一種天然的功能被認為是抵抗病毒入侵。之後又發現在植物RNA和DNA病毒的複製過程中有源自於病毒的小RNA的積累f3]，這些小RNA被認為引起病毒mRNA的切割，限制病毒的感染。因為在RNA沉默過程中諸如Dicer酶和Ago蛋白等一些基本蛋白存在於大部分的生物中，很自然人們就提出了RNA沉默作為一種保守的病毒防禦機制在生物中普遍存在。
1 RNA沉默的發現
公認的第一次發現RNA沉默這一現象的是由van der Krol，Napoli以及他們的合作者所做的未能在轉基因矮牽牛中過量表達查爾酮合成酶(CHS)的試驗。他們得出：轉基因RNA不僅抑制自身表達，也抑制內源基因的表達的結論，這一現象被稱為共抑制(CO—suppression)。之後．研究者觀察到沉默的GUS基因能夠阻止攜帶有GUS序列的馬鈴薯X病毒(PVX)的積累。這一發現直接導致了後來被稱為轉錄後基因沉默(PTGS)這樣一種序列特異性抗病毒防禦機制的提出。通過對表現出RNA沉默弱化現象的擬南芥不同突變種的鑑別，揭示了有關病毒誘導的基因沉默作用途徑的更多細節(4】。到了1 999年由Hamilton署llBaulcombet5】證實具有轉基因沉默現象的植物內有小的dsRNA累積，而dsRNA與轉基因高度同源。真正具有開創性意義的工作是由Fire和他的合作者四完成。他們發現：只要給秀麗桿菌注入少劑量的dsRNA，蟲體內就能被誘導產生他們稱之為RNA沉默的現象。通過不同生物RNA沉默路徑的阻斷實驗。科學家發現：RNA沉默具有很強的保守性，表明它在生物的發育、基因調節、抗病毒以及染色體構建等方面作為一種古老的機制而發揮重要的作用。
2 RNA沉默的過程
在植物中，控制病毒粒子的複製被認為是RNA沉默眾多作用中最主要的一種。儘管表達轉基因RNA可以引起RNA沉默．自然狀態下的RNA沉默更具適應性，通過識別“外來”分子而啟動這一過程。這種識別隨後被轉化為“效應”、“記憶”以及“預警”信號而傳遞給整個植株。雙鏈RNA分子被認為是最適宜的RNA沉默啟動者。因為絕大多數的病毒都是RNA病毒．通過形成雙鏈RNA複製酶進行病毒複製。所以假定這些分子為RNA沉默的引發者顯得很有意思。然而，情況要複雜得多．雖然大部分植物RNA病毒經由雙鏈而複製，但是這些RNA處於裸露狀態的機率卻很小，因為複製複合體被病毒複製蛋白和(或)衣殼蛋白所保護。病毒的複製通常發生在特定的複製區域．同時dsRNA在病毒或者宿主RNA解旋酶的作用下立即變得鬆散[7】。我們認為病毒的mRNA。也許會被植物定義為“異種”(aberrant)，它將會是一種重要的對象。也能夠在RNA依賴性RNA聚合酶(RdRP)的作用下形成雙鏈RNA。這樣就可以說明當植物感染單鏈DNA病毒一雙聯病毒(Geminiviruses)後形成病毒特異性的siRNA這一現象隅]。擬南芥的染色體編碼4種能將dsRNA切割成siRNA分子的類Dicer酶【9]。在一個正常的病毒感染的過程中．植物包含有大量的病毒來源的siRNA分子。這些siRNA隨後被用於兩個方面：一方面siRNA結構變得鬆散．其中的一條鏈組合進入RNA誘導的RNA沉默複合物(RISC)，定位和降解與siRNA同源的靶RNA；另一方面，植物中的RdRP利用siRNA作為同源mRNA的引物來合成dsRNA．之後dsRNA又被Dicer酶加工成次級siRNA。後一步導致了細胞內沉默信號的放大。植物中，RNA沉默通道中所形成的siRNA能夠從mRNA目的位置的5’端和3’端合成，表明傳遞性是雙向的。而線上蟲中，次級siRNA卻只能從mRNA目的位置的5’端合成[10]。這可能與植物中siRNA的每一條鏈都比較穩定而線上蟲中只有負鏈穩定有關。哺乳動物中，沉默信號的傳遞性據稱是不存在的。內源性的RdRP同時也被證實不是這一過程所必須的。在所有的真核生物RNA沉默過程中，2Ints的siRNA都能被觀察到並被認為是起到局部RNA沉默的作用⋯】，這種長度的siRNA引起的沉默信號傳遞是短距離的。在沒有信號放大的情況下能傳播10—15個細胞f12]。但是，在植物中還能夠產生一系列大小約為24nts的siRNA⋯。這些較長的siRNA可能與沉默信號的遠距離傳遞有關。這一能力使得植物RNA沉默通道中產生的siRNA能夠先於病毒在鄰近的細胞之問傳遞。RISC也被認為是事先被編碼好的．配合siRNA．迅速識別和消滅人侵病毒。
3 RNA沉默的抑制作為一種對抗機制
許多植物和動物病毒通過編碼抑制蛋白阻斷宿主的RNA沉默進程，這一阻斷作用發生在siRNA沉默途徑以及大部分的miRNA沉默途徑中的各個階段[13，14】。抑制蛋白在siRNA引導的RNA沉默的抑制過程中能夠抑制甚至是完全祛除siRNA的作用。抑制蛋白對miRNA引起的擬南芥RNA沉默的作用是導致擬南芥發育缺陷．這一缺陷是由Agol部分突變以及改變其他一些基岡的表達效率所致，這些相關基因主要在miRNA的合成以及植物體的新陳代謝過程中起作用。通過對一些沉默抑制蛋白的研究，對於它們的分子作用機理有了較深的了解，而這其中理解最透徹的是番茄叢矮病毒科病毒編碼的P19蛋白。P19蛋白並沒有影響由dsRNA形成siRNA的過程，但形成同向二聚體與siRNA結合在一起，阻止siRNA進入RISC[15,161。這樣，RNA沉默的效應物包括RISC就不能被激活。原來認為P21蛋白不影響細胞自主性RNA沉默。最近有研究指出。P19蛋白抑制RISC的活性與細胞自主性RNA沉默是聯繫在一起的rl71。但是，對於番茄從矮病毒屬病毒的感染，這一作用可以忽略掉．因為細胞自主性RNA沉默無法與快速複製的蘭花環斑病毒(CymRSV)相抗爭；在編碼抑制蛋白基因突變的植物細胞質中，病毒粒子大量聚集。但是，細胞自主性RNA沉默對於控制那些複製較慢的諸如馬鈴薯Y病毒屬的病毒來說卻是極為重要的．因為帶有HC—Pro基闌突變的菸草蝕紋病毒在細胞質里不能聚集。甜菜黃化病毒編碼的P21抑制蛋白和蕪菁花葉病毒編碼的P1/HC—Pro抑制蛋白可能具有和P19蛋白相類似的作用機制。對其他一些沉默抑制蛋白的作用機理也有一些假設．諸如獸棚病毒(一種寄生在果蠅等昆蟲體內的小RNA病毒)通過編碼的B2蛋白結合dsRNA和siRNA抑制siRNA的形成¨8】：P38蛋白直接抑制DCLl(RNaseHI家族的Dicer同源物)的活性c19]。黃瓜花葉病毒(CMV)編碼的2b蛋白是最早鑑定出的可以抑制轉錄後基因沉默(PTGS)的兩種抑制蛋白之一。一直以來科學家認為2 b蛋白對miRNA引起的RNA沉默很少甚至是不起作用。最近對2 b抑制蛋白的作用機制的研究又有了新的進展。通過誘導Agol等位基因部分突變。科學家發現：CMV編碼的2 b蛋白能夠阻斷miRNA引起的RNA沉默過程。最終引起植物生長的變異m211，其途徑主要通過直接與Agol蛋白酶結合，阻止其進入RISC，抑制其切割活性直接削弱RNA沉默以對抗宿主的防禦體系。
4 RNA沉默介導的植物抗病毒基因工程
4．1 RNA介導的對RNA病毒的抗性
科學家發現。轉基因表達病毒編碼蛋白的含量經常與植株所表現出來的病毒抗性不相關。一些試驗中表達的病毒相關蛋白含量極低甚至檢測不到，但植株仍表現出很高的病毒抗性．隨後通過表達非翻譯的轉基因提出了轉基因產生的RNA可以介導植物產生病毒抗性。Lindbo等五最先把這一現象和先前的共抑現象聯繫起來．提出轉基因能夠誘導出所有與轉基因序列相一致的RNA的觀點。在轉病毒基因這一過程中能夠誘導植株產生抗病性。這一RNA的特異性識別序列主要是由轉基因產生的siRNA所決定。因為在感染病毒和類病毒的野生型植株中也發現了sir．NA．不難得出RNA介導的病毒抗性是植物中天然存在的一種防禦機制的結論。科研人員通過構建反向重複(IR)序列siRNA的前體dsRNA對這一問題進行深入研究．發現反向重複序列的構建能夠顯著提高轉基因植物的抗性∞J。一般來說，轉病毒單鏈正義或者反義基因賦予植物的病毒抗性只有20%左右．但是轉入能夠產生dsRNA的IR序列的植物對病毒的抗性卻高達90%圳。很多試驗都已證明轉病毒正鏈RNA不能獲得滿意抗病性。而構建IR轉基因序列是一種獲得高效抗病性轉基因植物的重要途徑。由Tougou等人完成的工作使這種植物抗病性策略的有效性得到了佐證瞄】。大豆矮縮病毒(SbDV)是一種正義單鏈RNA病毒．之前從未見過有關抗SbDV轉基閡大豆的報導，他們通過轉入被GUS基因間隔的SbDV外殼蛋白(coat protein)的反向重複序列(分別來自於病毒的正義鏈和反義鏈)成功獲得了抗SbDV的轉基因大豆。研究人員在70株潛在的轉基因植株中篩選出3株成功轉入該目的基因的植株。56個T1代植株中有38株含有CP基因，通過蚜蟲接種SbDV病毒發現8株對SbDV表現出較強抗性，其中3株含有與SbDV．CP具有同源性的siRNA不含有SbDV特異性的RNA。另外5株兩者兼有，因此siRNA的產生直接導致了轉基因植物中病毒序列特異性的RNA誘導的沉默複合物(RNA．induced silencing complex，RISC)的出現，且RISC的出現先於感病症狀的出現。當病毒感染植株時，在病毒編碼的沉默抑制蛋白發揮作用前。病毒RNA就已經被快速而有效地識別並降解了。這一過程與病毒常規感染植株過程形成了鮮明的對比：病毒常規感染過程中。RNA沉默過程的滯後使病毒基因編碼的沉默抑制蛋白可以發揮作用對抗RNA沉默。研究還發現。RNA介導的植物抗病性的一個缺陷是當轉基因序列和病毒基因序列的非同源性高於10%的時候，轉基因就很難賦予植物抗病性[矧。為了獲得廣譜的病毒抗性，Bucher等四構建了一種全新的IR序列，這一序列融合了來自番茄斑萎病毒屬4個不同病毒種的長150nts的核苷酸序列。這一策略獲得了比較好的效果，此舉說明通過附加更多的病毒相關序列擴充轉基因結構。能夠使轉基因植物獲得更為廣譜的抗性。
4．2 RNA介導的對DNA病毒的抗性
感染了RNA病毒的植物細胞會產生病毒特異性的siRNA。這些siRNA被認為來自於病毒RNA複製過程中形成的dsRNA斷裂產物或者來自病毒RNA的二級結構。很有意思的事情是，一些植物DNA病毒，象花椰菜花葉病毒屬和雙病毒科中的一些種也是RNA沉默的對象[28,29J。在某些情況下。這種作用機制能讓植物從病毒感染中恢復過來，表明RNA沉默是一種廣泛存在的植物天然抗病毒策略。通過向植物轉入DNA病毒的正義和反義鏈RNA，科學家成功獲得了抗番茄金色花葉病毒(TGMV)、番茄黃曲葉病毒(TYLCV)以及番茄黃葉捲曲撒丁島病毒(TYLCSV)的株系。為進一步提高轉基因植物抗病性。Pooggin等i30通過在植物中表達菜豆金色花葉病毒屬黑鷹嘴豆黃花葉病毒(VMYMV)基因組某區域的IR結構，獲得了抗病恢復系植株。Zrachya及其同事[3¨通過構建針對CP基闋的IR序列獲得了抗番茄黃曲葉病毒的轉基崗植物。同樣的，Noris等[321和Ribeiro等[33】通過轉基因手段在植物中表達病毒相關的siR．NA，分別獲得了對番茄黃葉捲曲病毒(TYLCSV)和番茄褪綠斑駁病毒(ToCMoV)抗性的植株。與抗RNA病毒株形成鮮明對比的是對DNA病毒產生完全免疫的轉基閃植株尚未得到．這也說明病毒mRNA是RNA沉默的主要對象。
4．3轉外殼蛋白基因介導的病毒抗性在植物中轉入某一病毒外殼蛋白(coat pro．tein)基因，可以使植物產生對相關病毒的抗性，這一過程稱為外殼蛋白介導的抗性(coat protein．mediated resistance，CPMR)。CPMR的分子機制目前尚未完全弄清楚，針對不同病毒的CPMR分子作用機制很不相同阻】。最近研究發現，由轉外殼蛋白基因介導的抗性有可能不僅僅和外殼蛋白有關．還和RNA介導的抗性有關——高水平或者是廣譜的植物病毒抗性是由外殼蛋白和RNA干擾共同引起的。在植物中表達番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt virus．TSWV)的Ⅳ基因(nu—cleocapsid gene)所引起的受體植株的抗性被認為是由RNA沉默介導的[35J．但在試驗植株中轉基因的轉錄水平很低。植物獲得的抗性也僅局限於針對TSWV供體株．對其它番茄斑萎病毒屬成員並無抗性。由Kertbundit等人完成的工作也提到了轉番木瓜環斑病毒CP基因賦予番木瓜對病毒的抗性也是由RNA沉默所介導的m]．通過基因槍法獲得了8株表現病毒抗性的轉基因植株，Nothern blotting分析得知凹基因在7株中轉錄．但其中只有2株獲得表達蛋白。上述這些結果表明轉基因植株獲得的病毒抗性不是由coat pro．tein所引起而是由RNA沉默所介導的。對這一現象的解釋是：粒子槍轟擊將外源基因整合到宿主染色體上是一個相當複雜的過程．在整合位點上通常包含有多拷貝的轉基因，這些轉基因存在一定程度的重排；重排導致的基因融合、反向重複就有可能引起轉錄後基因沉默(PTGS)。Tougou等∞J通過轉大豆矮縮病毒(Soybean dwarf virusSbDV)cP基因的正鏈RNA到大豆中獲得了對這一病毒的抗性．樣株6產生的39株他中有29株顯示了SbDV抗性，且均可育，Nothern blotting可檢測到SbDV．CP的mRNA。接種病毒後，可檢測到SbDV特異性siRNA．未檢測到其他SbDV特異性RNA，說明轉基因植株對SbDV的抗性也是由RNA沉默引起的。
5 問題和展望
近幾年對RNA沉默機制的研究取得了較大的進展．對RNA沉默組成原件以及路徑有了更加深入的了解。但是，在這一過程當中還是存在很多問題有待解決。比如說最近的研究發現人類細胞中存在有大量的和siRNA以及miRNA相類似的小RNA存在。他們的潛在功能是調節幾乎所有的人類基因的表達。那么在RNA沉默過程當中到底牽涉有多少種的小RNA呢?這些小RNA又是如何產生的?而他們具體的生物學功能又是什麼?他們又是如何調控RNA沉默路徑的呢?在這其中又包含有一個潛在的問題：因為這些小RNA在5’端和3’端∞3都產生過修飾．目前的測序手段不能保證對這些小RNA進行完整的測定。但是下一代r圳測序手段應該能夠揭示這些小RNA的分子信息。對RNA沉默介導的植物抗病性的研究仍在繼續深入，在研究過程中一些新的現象伴隨著問題出現在研究者的面前：如甲基化[幻】、轉基因拷貝數、轉基因純合抑或雜合態、RNA沉默的發生位點以及環境因素等等如何對RNA沉默產生影響?對這些問題的進一步研究將大大促進對這一廣泛存在的植物天然抗病毒機制的深入了解。以RNA沉默作為理論基礎的研究在植物抗病毒的研究中表現出很高的套用潛力。這是因為，同以往的複製酶基因以及衣殼蛋白基因介導的植物病毒抗性相比較，它更為高效，特異性更強。雖然現在該技術離真正實現商業化利用比較遙遠，RNA沉默的分子機制也還沒有完全搞清楚，而且病毒還編碼各種RNA沉默抑制子來對抗這一機制。但是，隨著研究工作的深入，相信其分子機制的神秘面紗終究會被揭示．而基於這一理論基礎的植物抗病毒基因丁程亦將蓬勃發展．在植物抗病性研究和套用領域發揮重要作用。
