RNA抗干擾機制

RNA干擾是將雙鏈RNA導入細胞引起特異基因mRNA 降解的一種細胞反應過程,涉及多種蛋白質共同參與。此干擾機制可在轉錄、轉錄後和翻譯水平上實現。轉錄水平上的干擾機制是通過對靶基因染色質結構的改變，使其基因轉錄受限，導致表達系統的關閉。翻譯水平上的干擾機制，是通過抑制相應mRNA的翻譯,使相應的蛋白質表達受阻。RNA抗干擾能幫助我們研究基因的功能，同時它為我們提供了一個治療疾病的新途徑。

MicroRNA

在人體發育過程中起著意想不到的作用。

RNA抗干擾的發展

法國科學家稱核糖核酸沉默機制（RNA silencing）能夠抵抗人體中的病毒，不可思議的是，小RNA (miRNA)竟然是組成這一機制的基礎。

“科學家一直認為miRNA與調節內源基因有關，而小分子干擾核糖核酸（iRNA）能夠控制外源基因，尤其是病毒RNA基因，”該文的主要作者、來自法國斯特拉斯堡的植物分子生物學院的查利斯·亨利·萊西利亞在《科學》雜誌上說道。

科學家們先前的研究顯示，核糖核酸干擾（RNAi）能夠消滅植物以及昆蟲體內的病毒，但2013年還沒有研究表明它在脊椎動物也擁有類似功能。自從科學家們發現RNA沉默機制能夠壓抑內生反轉錄病毒，使其無法在植物、酵母、蚯蚓以及蒼蠅等等體內遊動，萊西利亞和他的同事就推斷哺乳動物體內的外源病毒基因的反轉錄移位功能應當也是同樣脆弱。因此他們選擇了一種原始的1型泡沫病毒（PFV-1）——一種與人體免疫缺損病毒（HIV）同類的逆轉錄酶病毒——作為實驗的模擬系統。

由於P19沉默干擾基因的表達，PFV-1病毒在人工“人體胚胎腎臟細胞株”（human embryonic kidney cells）中聚集並且變得十分明顯。這意味著，由於P19細胞控制著siRNA和miRNA，而且這兩種核糖核酸的路徑也控制著PFV-1在人體細胞中的繁殖。

為了確定人體RNA沉默機制的具體作用，研究者們將PFV-1病毒所含有的病毒基因序列與一種附有報告基因綠色螢光蛋白（GFP）連結在一起，然後使它們與人體胚胎腎臟細胞一起染上病毒。報告顯示，F11架構中的綠色螢光蛋白與F11mRNA聚集中所含有的綠色螢光蛋白比例完全不同。這一點使研究者們想到了miRNA轉錄抑制。利用DIANA-microT運算法則計算後發現F11序列與人體miR-32具有高度的相似性。

進一步的研究表明，miR-32沉默受到P19表達細胞的壓抑。同樣，受抗miR-32細胞控制的核酸低聚核苷酸使子代病毒的繁殖量增加了一倍，並不是像抗miR-32細胞所起的作用一樣。這意味著miR-32起著直接反病毒作用。

植物與昆蟲中，所有的核糖核酸干擾（RNAi）能夠消滅的病毒都含有可以抑制核糖核酸沉默的蛋白質。而在後來的研究結果顯示，PFV-1中含有一種叫做Tas的病毒反激活蛋白。

一種叫做“阿拉伯芥”的植物中，轉基因Tas能夠大量減少siRNAs，並且使干擾基因引發的細胞產生髮育變異現象，同時干擾miRNA的功能，例如植物葉子變長、長出鋸齒等。這意味著Tas具有抑制miRNA 和siRNA某種基本功能的作用，而這種功能是植物與哺乳動物共同擁有的。

類似Tas的另一種蛋白質，AC2，其中含有植物基因病毒，也是一種病毒反激活蛋白，同樣能夠壓抑RNA沉默機制。

2013年，研究者們認為每種類型的細胞都有自己獨有的miRNA細胞庫。萊西利亞說：“這樣的概念能夠部分解答一些有關病毒反應方面的問題。”他認為，在細胞種類中，優先繁殖的病毒是處在抗病毒miRNAs沒有表現的地方，或者表現並不明顯的地方。

MiRNA的反應也會導致基因準種群出現，如果病毒能夠快速使其基因組發生變異，例如HIV與流感病毒，它就能避免受到miRNA沉默機制的影響。“基因準種群的出現對於躲避抗病毒功能的影響是十分重要的，因此研究這種miRNA反應也十分重要，” 萊西利亞說。

這一研究小組並沒有發現人類細胞能夠利用siRNA來消滅病毒。“所以研究哺乳動物是用還具有利用siRNA來對付病毒的能力是一個十分有趣的課題，因為與蚯蚓、蒼蠅這些昆蟲相比，哺乳動物擁有更加先進的免疫系統，”麻省理工大學的飛利浦·賽摩說。他並沒有參加這次研究活動。雖然miRNAs是否是抗病毒反應的原因之一，或者只是偶然對病毒核糖核酸起到了沉默作用，但是他認為：“不論miRNAs的表達是否會抑制病毒傳染，這項研究都會引起科學界的廣泛關注。”

美國加州大學的丁守維（音譯）稱，未來的研究方向可能會包括測試幾百個人體microRNAs對諸如HIV病毒和流感病毒等病毒的反應，他也未參加此次研究。他說：“他們已經在細胞培養室做了試驗，如果在動物身上做相關實驗的話會引起科學界更大的關注。”

法國研究人員發現，哺乳動物細胞能關閉入侵的病毒。當病毒感染細胞後，它把自己的基因插入細胞的基因組，這樣在細胞複製時也產生許多的病毒拷貝。研究人員已經知道植物和昆蟲用RNA干擾使病毒基因沉默，在這個過程中，小的RNA分子將自己插入到基因表達機器中使某個基因沉默。動物也將RNA干擾用在一個調節功能上：它們在發育過程中通過RNA干擾改變自己基因的表達。Charles Henri Lecellier和同事2012年發現，人類細胞也用RNA干擾來阻礙一個侵襲哺乳類的病毒的積累。

核糖核酸干擾技術

轉錄後基因沉默（PTGS， post- transcriptional gene silencing）-最初被認為僅限於矮牽牛花和其它一些植物中的奇異現象，是目前分子生物學研究中一個最熱門的話題。過去幾年中，科研工作者已明確轉錄後基因沉默現象普遍存在於動、植物中，在機體防禦病毒入侵和轉座子沉默效應中起著重要作用。但是最激動人心的是轉錄後基因沉默現象的技術套用，即在多種有機體中套用核糖核酸干擾（RNA interfere ,RNAi）技術進行特異性的基因剔除以研究相應的基因功能。那么核糖核酸干擾現象是如何被發現？它是怎樣工作的？科研工作者怎樣把它套用到功能基因組學的研究中呢？

10多年前，Rich Jorgensan和他的同事在矮牽牛花中發現一種奇怪的現象。他們嘗試把由一強有力啟動子控制的基因pigment-produing導入矮牽牛花以加深花的紫色，結果不但顏色未加深，許多花呈現雜色甚至白色。Rich Jorgensan把這種現象稱為"共抑制"，因為外源性導入基因和內源性具有相似功能基因的表達都被抑制了。當時人們不知道這是一種轉錄後基因沉默。

雙鏈核糖核酸能導致轉錄後基因沉默首先來自於對線蟲的研究。1995年Guo和Kewphues試圖用反義核糖核酸來阻斷Par-1基因的表達以研究其功能。確實反義核糖核酸抑制了基因表達，出乎意料的是用作陰性對照的正義核糖核酸也抑制了基因表達。該結果一直讓人迷惑不解，直至三年後Fire和Mello進行了另一實驗才真正提出雙鏈核糖核酸能導致轉錄後基因沉默的理論。Fire和Mello發現把反義核糖核酸和正義核糖核酸的混合物導入線蟲後，其抑制效應遠遠強於單獨導入反義核糖核酸或正義核糖核酸的抑制效應。再後來Baulcomb和Hamilton首先發現是~25nt的核糖核酸能特異性抑制具有相應互補序列的基因表達。

那么核糖核酸干擾（RNAi）是怎樣工作的呢？首先外源導入的雙鏈核糖核酸(dsRNA)被切割為21~23nt的小分子干擾核糖核酸(siRNA)。Dicer, 作為特異性核糖核酸酶家族的一個成員，切割雙鏈核糖核酸為19~23nt小分子干擾核糖核酸（siRNA），這是一個依賴ATP的耗能過程. 切割後的 siRNA具有3'兩個核苷酸TT突出末端。然後siRNA結合到核糖核酸酶複合物上形成RNA誘導的基因沉默複合體（RISC，RNA-induced silencing complex）。該複合體依賴ATP釋能而解聚siRNA雙鏈成單鏈以激活RISC。活化的RISC通過由siRNA決定的鹼基互補配對原理切割具有同源序列的基因轉錄體，最終導致基因沉默效應。2012年前具體的切割機制還不明了，研究表明每個RISC包括單鏈siRNA和核糖核酸酶RNase。.

由於RNAi強大的基因沉默效應，有人提出了RNAi通路的效應擴增問題。RNAi通路的效應擴增可能是通過細胞複製外源導入的dsRNA或siRNA本身而實現的。另外，RISC的多次反覆使用也能擴增RNAi的基因沉默效應。

科研工作者已開始RNAi效應增強子和效應抑制子的研究，認為RNAi是機體細胞一種強有力的基因調控機制。但是在哺乳細胞中外源導入大分子dsRNA（>30nt）常常導致非特異性的基因沉默效應，因為它激活了核糖核酸酶RNaseL而導致非特異性的RNA降解。相反，siRNA（<30nt）不激活RNaseL，而是通過序列特異性的方式誘導基因沉默效應。該序列特異性方式非常嚴格，一個鹼基的錯配會顯著降低基因沉默效應。所以siRNA可以解釋如下，它是一種具有3'兩個核苷酸TT突出末端的21~23nt大小的雙鏈核糖核酸，作為RNAi的中介分子，通過序列互補配對法則特異性降解目的基因。

siRNA可以經化學合成，比如著名生物學公司Proligo、Orbigen在siRNA合成方面處於世界領先水平，它們既提供即用型siRNA，也提供標記生物素、螢光素和磷酸等的siRNA更方便監測其抑制特異基因表達的效果

siRNA也可以通過體外轉錄獲取。它相對便宜，尤其適合於同時合成多個siRNA。雖然理論上說，任何一個具有3'兩個核苷酸TT突出末端的19~23nt小分子干擾核糖核酸 siRNA都具備序列特異性的基因沉默效應，但是由於位置效應，比如某些序列，尤其是調控序列易被蛋白質附著而阻止RISC的抑制效應，所以科研工作者首先合成2~4個siRNA進行預實驗以選定作用最佳者。RNA專家Ambion公司提供通過體外轉錄獲取siRNA的商品化試劑盒，使這一選擇過程簡單方便。

2012年外源注射和轉染是轉運siRNA到細胞或機體的主要途經，之後基因沉默效應可以持續數天，同時傳至下一代細胞，但終將短時間內消失，因此，2012年許多科研小組開發了siRNA的表達質粒，通過瞬時轉染或穩定轉染以達到在細胞內不斷表達siRNA的目的。有些質粒是表達小髮夾結構RNAs（shRNAs, small hairpin RNAs）, 在細胞內它被加工處理為siRNA樣分子，誘導基因沉默。該質粒是在polyMeraseⅢ啟動子和4~5個鹼基T轉錄終止信號中插入shRAN。由於polyMeraseⅢ的特性，轉錄常常在第二個T終止，插入序列摺疊成step-loop結構並帶有3'-UU突出末端。該質粒設計是基於線蟲、果蠅等中的實驗結果，因為其中的基因沉默效應就是通過step-loop而誘導。另外一種siRNA表達質粒是把編碼正義和反義的siRNA分別受控於各自的polyMeraseⅢ啟動子。兩種質粒的基因沉默效應相當。Invivogen公司和Imgenex公司都有操作簡單、作用有效的商品化試劑盒提供。而Gene Therapy System 公司的siRNA構建試劑盒則完全採用了不同的機制。該試劑盒首先PCR合成目標序列，然後由T7RNA多聚酶進行體外轉錄，經退火和純化處理的體外轉錄dsRNA模板被重組的Dicer酶切割，從而快速、高效地產生大量小分子干擾RNA（siRNAs）。產生的siRNAs混合物，比單一形式的siRNA更可能導致基因表達沉默。

基於2001年-2013年的發表文獻和一些實驗經驗，siRNA的設計可遵循以下幾點進行1）選擇以鹼基A或G開始的19~21nt大小的目的mRNA。因為RNA polyMeraseⅢ啟動子只有在第一個轉錄鹼基是嘌呤時才能有效作用。2）針對目的mRNA一般選擇2~4個不同序列，GC含量為30~50%，避免四個鹼基T或A的連續序列，避免選擇起始密碼下游50~100nt、終止密碼上游100nt以及5'和3'的非編碼區域，BLAST檢查設計序列的特異性。3）設計適當的實驗對照，比如設計有1~2個鹼基錯配的序列，或者是隨機變更siRNA的鹼基排列順序。

RNAi的研究颳起了科學界的風暴，siRNA迅速有效抑制特異基因功能的性質促使科研工作者不斷深入完善該領域的研究。RNAi可能是未來發展基因治療策略的新希望所在。RNAi技術必將帶來功能基因組學的革命。

10 May 2005

Human RNA silences viral DNA

RNA silencing can defend against viruses in humans, French scientists report in this week's Science. Surprisingly, say the scientists, microRNA (miRNA) appears to form the basis of this system. "MiRNAs were thought to be involved in the regulation of endogenous genes, whereas exogenous RNAs, in particular viral RNAs, were thought to be regulated by siRNA [small interfering RNA]," lead author Charles-Henri Lecellier at the Institute of Plant Molecular Biology in Strasbourg, France, told The Scientist.

Prior studies have revealed that RNA interference can destroy viruses in plants and insects, but a similar role in vertebrates has not been demonstrated. Since RNA silencing can suppress endogenous retroviruses from mobilizing in plants, yeast, worms, and flies, Lecellier and colleagues reasoned that retrotransposition of mammalian exogenous viruses might also prove vulnerable. They chose as their model system the primate foamy virus type 1, a retrovirus akin to HIV.

PFV-1 accumulation in cultured human embryonic kidney cells was strongly enhanced by the expression of the P19 silencing suppressor, suggesting that a siRNA or miRNA pathway limited PFV-1 replication in human cells, because P19 specifically binds to and inactivates both. To identify the target and means of human RNA silencing, the investigators fused viral sequences spanning the PFV-1 genome to a green fluorescent protein (GFP)–tagged reporter gene into constructs cotransfected with PFV-1 into baby hamster kidney cells. Northern and Western analysis revealed GFP levels from construct F11 were disproportionately reduced compared to F11 mRNA accumulation, which reminded researchers of miRNA translational inhibition. The DIANA-microT algorithm revealed a high probability match between the F11 sequence and the human miR-32.

Further studies demonstrated miR-32 silencing was suppressed in P19-expressing cells. Also, anti-miR-32 locked nucleic acid oligonucleotide almost doubled progeny virus production, unlike anti-miR-23, suggesting miR-32 has a direct, sequence-specific antiviral effect. In plants and insects, all viruses targeted by RNA interference encode proteins that suppress RNA silencing. Further studies found that in PFV-1, Tas, a viral transactivator, was that protein.

In Arabidopsis, transgenic Tas expression strongly decreased siRNAs and led to developmental anomalies reminiscent of those elicited by suppressors interfering with miRNA functions, such as leaf elongation and serration, suggesting Tas suppresses a fundamental step conserved from plants to mammals shared between the miRNA and siRNA pathways. Like Tas, another protein, AC2, encoded by the DNA plant viruses, geminiviruses, is a viral transactivator that can suppress RNA silencing. "We want to investigate whether transactivation and suppression are linked or completely separate," Lecellier said.

Researchers currently think each cell type harbors its own specific miRNA repertoire, Lecellier said. "This idea could partially explain some of the differences in viral permissivity observed between specific tissues," he said, with viruses preferentially replicating in cell types where antiviral miRNAs are not expressed or are only weakly expressed.

A miRNA response could also lead to the emergence of viral quasispecies, as viruses that can rapidly introduce synonymous mutations into their genomes, such as HIV or influenza, do so to evade silencing by miRNA. "The emergence of quasispecies is important for resistance to antiviral strategies, so studying this miRNA response could be important for studying resistance," Lecellier said.

The team saw no evidence that human cells used siRNAs to disable viruses. "So it'd be interesting to investigate whether or not mammals have lost the ability to respond to viruses using siRNAs because they have a more advanced immune system than plants and flies and worms," said Phillip Zamore at the University of Massachusetts, who did not participate in this study. It was uncertain whether the miRNAs were part of a dedicated antiviral response or whether they accidentally silenced viral RNA, he said. "It'd be interesting to see whether expression of miRNAs are vastly upregulated in viral infection," he told The Scientist.

Future directions should involve testing any of the several hundred human microRNAs against viruses such as HIV and influenza, said Shou-Wei Ding at the University of California at Riverside, who did not participate in this study. "Also, they studied this in cell culture, and it'd be interesting to look at this at the whole animal level," Ding told The Scientist.

The Scientist

May 10, 2005

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