所謂real-time Q-PCR技術，是指在PCR反應體系中加入螢光基團，利用螢光信號累積實時監測整個PCR進程，最後通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。利用螢光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環擴增產物量的變化,通過Ct值和標準曲線的分析對起始模板進行定量分析。
基本介紹
- 外文名：Real Time Q-PCR
- 方法：曲線對未知模板進行定量分析
- 介質：螢光信號
- 分析：Ct值和標準曲線
原理,目的,套用前景,
原理
PCR反應過程中產生的DNA拷貝數是呈指數方式增加的，隨著反應循環數的增加，DNA聚合酶的失活,dNTP和引物的枯竭，反映副產物焦磷酸對合成反應的阻害等原因，最終PCR反應不再以指數方式生成模板，從而進入平台期。在傳統的PCR中，常用凝膠電泳分離並用螢光染色來檢測PCR反應的最終擴增產物，因此用此終點法對PCR產物定量存在不可靠之處。
在real-time Q-PCR中，對整個PCR反應擴增過程進行了實時的監測和連續地分析擴增相關的螢光信號，隨著反應時間的進行，監測到的螢光信號的變化可以繪製成一條曲線。在PCR反應早期，產生螢光的水平不能與背景明顯地區別，而後螢光的產生進入指數期、線性期和最終的平台期，因此可以在PCR反應處於指數期的某一點上來檢測PCR產物的量，並且由此來推斷模板最初的含量。
為了便於對所檢測樣本進行比較，在real-time Q-PCR反應的指數期，首先需設定一定螢光信號的域值，一般這個域值（threshold）是以PCR反應的前15個循環的螢光信號作為螢光本底信號（baseline），螢光域值的預設設定是3～15個循環的螢光信號的標準偏差的10倍。如果檢測到螢光信號超過域值被認為是真正的信號，它可用於定義樣本的域值循環數（Ct）。Ct值的含義是：每個反應管內的螢光信號達到設定的域值時所經歷的循環數。研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存線上性關係，起始拷貝數越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，因此只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。
目的
（1）對起始模板進行定量；
（2）對某個基因進行快速/無污染的定性檢測。
優點
（1）動力學範圍較寬：可分析少量的樣本，如臨床活組織切片檢查，可以檢測少於5個拷貝的目標序列；
（2）用適當的內參物和計算方法，可使平均變異係數在I%一2%，在低水平的基因表達下也可分析基因表達的細微變化；
（3）自動化程度高；
（4）real-time PCR在封閉的容器中進行，減少了操作造成的污染。
缺點
（1）易受影響，如臨床檢驗或法醫鑑定一些體內的流體物質，其中會有抑制劑存在食物中的微生物會被有機酚類抑制，一般選用適當的DNA聚台酶(如Tfl、Pwa、Tth等)，這些酶可以排除抑制劑的干擾；
（2）分析基因表達，RNA易降解，因此提取時要保證RNA 的完整性，儘可能除去核酸酶、基因組DNA、RT或PCR抑制劑的污染；
（3）採集、保存和運輸都會影響RNA的品質；
（4）反轉錄過程也會使RNA變性。但是最主要的是人員操作，使用real-time PCR分析基因表達，引物的設計必須嚴格遵循標準，確保結果的準確性。
套用前景
隨著技術不斷改進和發展，目前real-time Q-PCR已成為科研的主要工具，該技術未來的套用前景是令人鼓舞的，一方面real-time Q-PCR技術與其它分子生物學技術相結合使定量極微量的基因表達或DNA拷貝數成為可能。另一方面螢光標記核酸化學技術和寡核苷酸探針雜交技術的發展以及real-time Q-PCR技術的套用，使定量PCR技術有一個足夠的基礎為廣大臨床診斷實驗室所接受，將有助於臨床醫生對疾病的診斷和治療。其中最主要的套用集中在以下幾個方面：
（1）DNA 或RNA 的絕對定量分析，包括病原微生物或病毒含量的檢測，轉基因動植物轉基因拷貝數的檢測，RNAi 基因失活率的檢測等；
（2）基因表達差異分析。例如比較 經過不同處理樣本之間特定基因的表達差異 ( 如藥物處理、物理處理、化學處理等 ) ，特定基因在不同時相的表達差異以及cDNA 晶片或差顯結果的確證；
（3）基因分型，例如SNP檢測，甲基化檢測等。
