逆轉錄PCR

逆轉錄PCR（reverse transcription PCR）或者稱反轉錄PCR（reverse transcription-PCR, RT-PCR），是聚合酶鏈式反應（PCR）的一種廣泛套用的變形。在RT-PCR中，一條RNA鏈被逆轉錄成為互補DNA，再以此為模板通過PCR進行DNA擴增。

基本介紹

• 中文名：逆轉錄PCR
• 外文名：reverse transcription PCR
• 別名：逆轉錄聚合酶鏈式反應
• 性質：聚合酶鏈式反應廣泛套用的變形
• 模板：一條RNA鏈被逆轉錄成為互補DNA
• oligo：多聚體，相當於mRNA引物
• AMV RT：禽類成髓細胞瘤病毒逆轉錄酶

技術介紹

由一條RNA單鏈轉錄為互補DNA（cDNA）稱作“逆轉錄”，由依賴RNA的DNA聚合酶（逆轉錄酶）來完成。隨後，DNA的另一條鏈通過脫氧核苷酸引物和依賴DNA的DNA聚合酶完成，隨每個循環倍增，即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶H降解，留下互補DNA。

RT-PCR的指數擴增是一種很靈敏的技術，可以檢測很低拷貝數的RNA。RT-PCR廣泛套用於遺傳病的診斷，並且可以用於定量監測某種RNA的含量。檢測基因表達的方法，參見Northern Blot法。

RT-PCR的關鍵步驟是在RNA的反轉錄，要求RNA模版為完整的且不含DNA、蛋白質等雜質。常用的反轉錄酶有兩種，即鳥類成髓細胞性白細胞病毒（avian myeloblastosis virus，AMV）反轉錄酶和莫羅尼鼠類白血病病毒（moloney murine leukemia virus，MMLV）反轉錄酶。

在完成逆轉錄過程之後，通過PCR進行定量分析的時候，隨著技術的發展，real-time PCR（實時螢光PCR）或ddPCR（數字PCR）技術也被用來做定量分析，它們比普通PCR進行定量分析時靈敏度更高，定量更精確。

相關試劑

oligo：多聚體，相當於mRNA引物

AMV RT：禽類成髓細胞瘤病毒逆轉錄酶

MMLV RT：莫洛尼鼠白血病病毒逆轉錄酶

dNTPs：脫氧核苷酸

RNase抑制劑：防止RNase污染

PCR Buffer：RT-PCR緩衝液

MgCl2：2價鎂離子

各步驟的目的

預變性

破壞DNA中可能存在的較難破壞的二級結構。使DNA充分變性，減少DNA複雜結構對擴增的影響，以利於引物更好的和模板結合，特別是對於基因組來源的DNA模板，最好不要吝嗇這個步驟。此外，在一些使用熱啟動Taq酶的反應中，還可激活Taq酶，從而使PCR反應得以順利進行。

三種循環

①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93℃左右一定時間後，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；

②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈後，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；

③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按鹼基配對與半保留複製原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留複製鏈。

延伸時間原因

用PCR儀擴增時，變性-退火-延伸循環完成後，繼續72度延伸了10分鐘的原因：

1、延伸時間取決於待擴增DNA片段的長度，當然是在反應體系一定的條件下。例如，使用TaqDNA聚合酶，72度時的鹼基摻入率為35-100bp/s，因此延伸速率為1kb/min。

2、根據延伸速率推得，擴增1kb以內的DNA片段1min即可，而3-4kb則需要3-4min，依次照推。通常在最後一輪要適當的將延伸時間延長至4-10min，這樣做是使PCR反應完全以提高擴增產量。

3、繼續72度延伸了10分鐘除了可以使PCR反應完全以提高擴增產量外，還有一個作用是：在用普通Taq酶進行PCR擴增時在產物末端加A尾的作用，可以直接用於TA克隆的進行。

PCR引物的選擇

對靶序列中潛在的引物位點進行分析， 這些位點應該不會形成同源多聚體結構，也沒有明顯的形成二級結構的趨勢，不會自身互補，與基因組中的其他序列無顯著的同源性。

（1）依據寡核苷酸引物與其靶序列形成雜合分子的熔解度的計算中提供的公式計算各引物的熔解溫度。

（2）選擇一對匹配完好的正向和反向引物。兩條引物的G+C含量相似，將產生一種大小和鹼基組成合適的產物。兩條引物與所擴增片段的GC含量都應在40%-60%之間。

（3）對寡核苷酸的長度和/或位置進行細調。使得引物的3‘末端核苷酸為G或C。檢查兩條寡核苷酸之間有無明顯的互補性。作為一條經驗性的規律，一條引物上不該含有三個連續的與另一條引物互補的核苷酸。

注意事項

（1）雙鏈DNA的變性溫度是由雙鏈中C+G的含量決定的，C+G含量越高，模板DNA的溶解溫度就越高。在選擇的變性溫度下，模板鏈越長變性所需時間就越長。如果變性溫度過低或變性時間過短，會使僅僅富含A+T區域變性。當模板DNA的G+C含量超過55%的時需要更高的變性溫度。

（2）復性過程採用的溫度至關重要如果復性溫度太高，寡核苷酸引物不能與模板很好的復性，擴增效率將會降低。如果復性溫度太低，引物將產生非特異性復性，從而導致非特異性的DNA片段的擴增。復性通常在比理論計算的引物和模板的溶解溫度低3—5℃的條件下進行。

（3）PCR擴增所需的循環數目決定於反應體系中起始的模板拷貝數以及引物延伸和擴增的效率。一旦PCR反應進入幾何級數的增長期，反應會一直持續下去，直至某一成分成為限制因素。從這一點上來說，擴增產物中絕大多數應該是特異性的擴增產物，而非特異性的擴增產物應該低到難以檢測到的程度。用TaqDNA聚合酶（效率為0.7）在一個含有10的5次方個拷貝的靶序列的反應體系中進行30個循環後往往可以做到上述的理想情況。

常見問題

RT-PCR常見問題

（一）RT-PCR靈敏度：在瓊脂糖凝膠分析中看到少量或沒有RT-PCR產物。
可能原因	解決方案
RNA被降解	在用來驗證完整性之前先在變性膠上分析RNA。 使用良好的無污染技術分離RNA。 在將組織從動物體取出後立刻處理。
RNA中包含逆轉錄抑制劑	通過乙醇沉澱RNA除去抑制劑。用70%（體積分數）乙醇對RNA沉澱進行清洗。可以加入糖元（0.25μg/μL到0.4μg/μL）以幫助小量樣品RNA的恢復。 逆轉錄抑制劑包括：SDS，EDTA，甘油，焦磷酸鈉，亞精胺，甲醯胺和胍鹽。 將對照RNA同樣品混合，同對照RNA反應比較產量以檢驗抑制劑。
用於合成cDNA第一鏈合成的引物沒有很好退火	確定退火溫度適合您的引物。對於隨機六聚體，建議在反應溫度保溫之前先在25℃保溫10min。 對於基因特異性引物（GSP），可以試一下其他GSP，或換用oligo（dT）或隨機六聚體確定GSP是反義序列。
起始RNA量不夠	增加RNA量。
RNA模板二級結構太多	將RNA和引物在不含鹽及緩衝液的條件下變性/退火。 提高逆轉錄反應溫度。 注意：不要在＞60℃時使用oligo（dT）引物，選擇一個在反應溫度可以退火的GSP。 對於＞1kb的RT-PCR產物，保持反應溫度≤65℃。
（二）RT-PCR特異性：在瓊脂糖凝膠分析中觀察到非預期條帶。
可能原因	解決方案
富含G+C的模板	對於G+C含量＞50%的模板，使用PCRx Enhancer Solution。
鎂離子濃度太低	從1mmol/L到3mmol/L，間隔0.5mmol/L進行一系列反應，確定對於每個模板和引物對的最佳鎂離子濃度。
引物和模板非特異性退火	在第一鏈合成中使用GSP，而不是隨機引物或oligo（dT）。試用允許高溫cDNA合成的GSP。
RNA中沾染了基因組DNA	使用擴增級DNaseⅠ處理RNA。使用沒有逆轉錄的對照反應檢測DNA污染。
（三）PCR忠實性：PCR在產物序列中引入了錯誤。
可能原因	解決方案
聚合酶忠實性低	使用帶有校正活性的熱穩定聚合酶。
循環數太多	降低循環數。