《一種雞傳染性支氣管炎活疫苗效力檢測方法》是瑞普（保定）生物藥業有限公司於2014年12月31日申請的發明專利，該專利的申請號為2014108485462，公布號為CN104694667A，授權公布日為2015年6月10日，發明人是張麗青、梁武、郁宏偉、劉濤、柳珊、劉超、朱秀同、楊保收、鄒立宏，該發明屬於生物技術領域。
《一種雞傳染性支氣管炎活疫苗效力檢測方法》包括以下步驟：（1）設計引物；（2）病毒稀釋、接種及培養；（3）病毒收穫；（4）PCR檢測；（5）毒價計算。該發明操作簡單，測定條件均一，可控性強，批間誤差小，縮短了雞傳染性支氣管炎病毒效價的檢測周期，適用範圍廣。
2019年9月29日，《一種雞傳染性支氣管炎活疫苗效力檢測方法》獲2018年河北省專利獎優秀獎。
（概述圖為《一種雞傳染性支氣管炎活疫苗效力檢測方法》摘要附圖）
基本介紹
- 中文名：一種雞傳染性支氣管炎活疫苗效力檢測方法
- 公布號：CN104694667A
- 公布日：2015年6月10日
- 申請號：2014108485462
- 申請日：2014年12月31日
- 申請人：瑞普（保定）生物藥業有限公司
- 地址：河北省保定市工業園區騰飛路793號
- 發明人：張麗青、梁武、郁宏偉、劉濤、柳珊、劉超、朱秀同、楊保收、鄒立宏
- Int.Cl.：C12Q1/70(2006.01)I、C12Q1/68(2006.01)I、C12R1/93(2006.01)N
- 代理機構：石家莊冀科專利商標事務所有限公司
- 代理人：李羨民、郭紹華
- 類別：發明專利
- 生物保藏 ：CCTCC NO：V201436 2014.11.12
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,改善效果,附圖說明,權利要求,實施方式,榮譽表彰,
專利背景
雞傳染性支氣管炎病（Infectious Bronchitis，IB），是一種由冠狀病毒科的傳染性支氣管炎病毒（Infectious Bronchitis Virus，IBV）引起的雞的急性、高度接觸性傳染病，給全世界養雞業帶來了巨大損失。2014年12月前，接種疫苗是防治該病的有效措施。因此雞傳染性支氣管炎活疫苗半成品毒液和成品疫苗的效力檢測（效價檢測）非常重要。
截至2014年12月，雞傳染性支氣管炎活疫苗效力檢測的標準方法是雞胚感染法（半數雞胚感染量，EID50），《中華人民共和國獸藥典》（三部，2010年版）（以下簡稱《中國獸藥典》）中具體描述：按瓶簽註明羽份，將疫苗用無菌生理鹽水稀釋成1羽份/0.1毫升，然後作10倍系列稀釋，取3個適宜稀釋度，各尿囊腔內接種10日齡SPF雞胚5枚，每胚0.1毫升，置37℃下孵育144小時，24小時以內死亡的雞胚棄去不計，根據接種後24～144小時的死胚及144小時活胚中具有胎兒失水、蜷縮、發育小（接種胎兒比對照最輕胎兒重量低2克以上）等特異性病痕者的雞胚總數計算EID50。每羽份應不低於10EID50。雞胚感染法是當前精確定量的常用方法，已成為病毒學研究和活病毒生物製品質量監測的重要方法。
大多數IBV致雞胚病變，病毒經尿囊腔途徑接種到10～11日齡雞胚後生長良好，病毒接種後數天可看到特徵性的雞胚變化，在照蛋時矮小胚僅有輕微的活動，打開雞胚的氣室端，可見雞胚縮成球狀，爪畸形，壓在頭上，羊膜增厚並與胚體粘連。經系列稀釋病毒接種雞胚後，雞胚出現規律性的死亡和特徵性的雞胚病變，這類IBV效價測定時適用雞胚感染法。國內常用的疫苗毒株H120株、H52株、M41株、W93株均適用。
但有一部分IBV不致雞胚病變或病變不明顯。病毒經尿囊腔途徑接種到10～11日齡雞胚後數天，雞胚很少有死亡，且病變不明顯，數次傳代後，病變依舊不明顯，經系列稀釋病毒接種雞胚後，病變雞胚數量少且不規律。這樣給雞胚感染法結果判定帶來直接的影響，效價測定結果大相逕庭，是毒價低還是該種方法對其不適用？這為該病毒的研究帶來了巨大的困難。鑒於當前雞胚感染法存在的不足以及近幾年部分新發現流行毒株的特點，找到一種適合檢測該類病毒（罕見胚胎死亡，不致雞胚病變或病變不明顯，無法依據雞胚病變判定效價）效價的有效方法刻不容緩。
發明內容
專利目的
《一種雞傳染性支氣管炎活疫苗效力檢測方法》所要解決的技術問題是克服2014年12月前已有效力檢測方法之缺陷、提供一種PCR與雞胚感染法相結合來測定雞傳染性支氣管炎活疫苗效力的檢測方法，以提高效力檢測精確度。
技術方案
《一種雞傳染性支氣管炎活疫苗效力檢測方法》包括以下步驟：
（1）設計引物：引物對1，其上游引物F1、下游引物R1序列分別為：
F1：SEQ ID NO.1；（5’-GACAAGCAGAGTCTTGT-3’）；
R1：SEQ ID NO.2；（5’-GCAACCCACACTATACC-3’）；
引物對2，其上游引物F2、下游引物R2序列分別為：
F2：SEQ ID NO.3；（5’-AACAAGGTAGTTGTCCATTG-3’）；
R2：SEQ ID NO.4；（5’-CCATTAATAAAGTAGGCTAGGGC-3’）；
引物對3，其上游引物F3、下游引物R3序列分別為：
F3：SEQ ID NO.5；（5’-CAGGTATGGCTTGGTCTAGCAG-3’）；
R3：SEQ ID NO.6；（5’-CTGAGCTGTTTGTGTTTGGTAAGT-3’）；
（2）病毒稀釋、接種及培養：雞傳染性支氣管炎病毒待檢樣品作10倍系列稀釋，取3個適宜稀釋度，各尿囊腔內接種10日齡SPF雞胚5枚，每胚0.1毫升，置37℃下繼續孵育；
（3）病毒收穫：病毒接種後，24小時時照蛋1次，棄去死胚不用，72小時時將雞胚置於2～8℃中冷卻4～24小時，氣室向上直立。無菌收集尿囊液，標記，-20℃保存備用；
（4）PCR檢測：
a.提取總RNA：將待檢樣品尿囊液、陰性對照和陽性對照分別取樣300微升，提取總RNA，以20微升無RNA酶水溶解；
b.RT-PCR反應：RT-PCR反應體系為25微升，包括：10×PCRbuffer2.5微升；dNTPMixture（10毫摩爾/升each）2.5微升；25毫摩爾/升MgCl25微升；RNA酶抑制劑0.5微升；反轉錄酶0.5微升；Taq酶0.5微升；上游引物（10微摩爾/升）1微升；下游引物（10微摩爾/升）1微升；總RNA溶解液3.5微升；ddH2O8微升。RT-PCR反應程式為：50℃30分鐘；95℃預熱2分鐘；94℃變性40秒，51℃復性30秒，72℃延伸1分鐘，30個循環；72℃延伸10分鐘。
c.電泳分析：取5微升PCR產物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳，而後以凝膠成像系統進行分析，出現特定大小的目的條帶者即判斷為陽性（該雞胚雞傳染性支氣管炎病毒感染陽性）。
（5）毒價計算：統計接種後72小時時的雞胚尿囊液（包括24～72小時死亡胚和72小時活胚）PCR檢測陽性的雞胚總數，按照Reed-Muench法計算病毒液或活疫苗的效價。
步驟（1）、（4）中，使用的引物對1設計在雞傳染性支氣管炎病毒基因組保守區N蛋白基因上，擴增目的片段大小為438bp；引物對2設計在雞傳染性支氣管炎病毒S1蛋白基因上，目的片段大小為292bp；引物對3設計在雞傳染性支氣管炎病毒S1蛋白基因上，目的片段大小為635bp。
步驟（2）中，待檢樣品為雞傳染性支氣管炎病毒毒液或活疫苗。若待檢樣品為病毒毒液，直接用無菌生理鹽水或PBS作10倍系列稀釋；若待檢樣品為活疫苗，按瓶簽註明羽份將疫苗用無菌生理鹽水或PBS稀釋成1羽份/0.1毫升，然後作10倍系列稀釋。
步驟（4）中三對引物的RT-PCR反應體系和反應程式相同。
步驟（5）中，如果孵育24～36小時各稀釋度毒液接種的雞胚均60%以上（包括60%）存活；且計算的病毒效價落在各個稀釋度之間，陽性/陰性比率反映出系列稀釋的效果，檢測結果視為有效。
改善效果
（1）《一種雞傳染性支氣管炎活疫苗效力檢測方法》PCR與雞胚感染法相結合，同傳統雞胚感染法相比，避免了目測的誤差和人為因素導致的結果誤差，使得測定條件均一、可控性強，特異性強，敏感度高，批間誤差小。
（2）該發明既可以檢測致雞胚病變類雞傳染性支氣管炎病毒，又可以檢測不致雞胚病變或病變不明顯類雞傳染性支氣管炎病毒，適用範圍更廣。
（3）傳統的雞胚感染法中結果判定依賴於病變和胚胎體重變化，要求檢測用蛋大小均勻一致。《一種雞傳染性支氣管炎活疫苗效力檢測方法》方法檢測用蛋為任意選擇的普通SPF雞胚，不限定大小差異，材料選擇範圍更寬。
（4）與傳統的檢測方法相比，檢測周期縮短了66～68小時，提高了檢測效率。
（5）該發明不直接檢測待檢毒液，檢測的是各梯度稀釋病毒培養產物雞胚尿囊液，不受待檢毒液中失活病毒影響，避免了普通PCR方法假陽性（PCR方法既能檢測活病毒，又能檢測失活病毒），檢測結果更準確。
（6）該發明三對引物的RT-PCR反應條件完全相同，可同時檢測幾種不同毒株的效價，節省了時間成本，降低了對試驗設備的要求，且使用普通PCR儀即可，不需使用梯度PCR儀。
（7）該發明PCR方法既有通用引物，能用於區分傳支病毒和其它禽類病毒；又有特異性引物，能用於雞傳染性支氣管炎病毒分型鑑定。
附圖說明
圖1第一組接毒72小時時PCR凝膠電泳圖；
圖2第一組接毒144小時時PCR凝膠電泳圖；
圖3引物對2的PCR凝膠電泳圖；
圖4引物對3的PCR凝膠電泳圖；
圖5第一組引物對1的PCR凝膠電泳圖；
圖6第一組引物對2的PCR凝膠電泳圖；
圖7第一組引物對3的PCR凝膠電泳圖；
圖8引物對1特異性試驗PCR凝膠電泳圖；
圖9引物對2特異性試驗PCR凝膠電泳圖；
圖10引物對3特異性試驗PCR凝膠電泳圖。
圖1～圖4坐標中標號：M為DL2000Marker；＋為陽性對照；－為陰性對照；1～5為10稀釋度5個樣；6～10為10稀釋度5個樣；11～15為10稀釋度5個樣；
圖5～圖7坐標中標號：M為DL2000Marker；＋為陽性對照；－為陰性對照；1～5為10稀釋度5個樣；6～10為10稀釋度5個樣；11～15為10稀釋度5個樣；
圖8和圖10坐標中標號：M為DL2000Marker；1為H120株；2為H52株，3為M41株；4為W93株；5為RP-1；6為NDV LaSota株；7為AIV Hp株；8為IBDV B87株；－為陰性對照；
圖9坐標中標號：M為DL2000Marker；1為RP-1；2為H120株；3為H52株，4為M41株；5為W93株；6為NDV LaSota株；7為AIV Hp株；8為IBDV B87株；－為陰性對照；
圖1～圖10坐標中標號：a：2000bp；b：1000bp；c：750bp；d：500bp；e：250bp；f：100bp。
1.《一種雞傳染性支氣管炎活疫苗效力檢測方法》其特徵是，包括以下步驟：
（1）設計引物：引物對1，其上游引物F1、下游引物R1序列分別為：
F1：SEQ ID NO.1；
R1：SEQ ID NO.2；
引物對2，其上游引物F2、下游引物R2序列分別為：
F2：SEQ ID NO.3；
R2：SEQ ID NO.4；
引物對3，其上游引物F3、下游引物R3序列分別為：
F3：SEQ ID NO.5；
R3：SEQ ID NO.6；
所述引物對1～引物對3分別用於不同的RT-PCR反應；
（2）病毒稀釋、接種及培養：雞傳染性支氣管炎病毒待檢樣品作10倍系列稀釋，取3個適宜稀釋度，各尿囊腔內接種10日齡SPF雞胚5枚，每胚0.1毫升，置37℃下繼續孵育；
（3）病毒收穫：病毒接種後，24小時時照蛋1次，棄去死胚不用，72小時時將雞胚置於2～8℃中冷卻4～24小時，氣室向上直立；無菌收集尿囊液，標記，-20℃保存備用；
（4）PCR檢測：
a.提取總RNA：將待檢樣品尿囊液、陰性對照和陽性對照分別取樣300微升，提取總RNA，以20微升無RNA酶水溶解；
b.RT-PCR反應：RT-PCR反應體系為25微升，包括：10×PCRbuffer2.5微升；dNTPMixture2.5微升，濃度為10毫摩爾/升；25毫摩爾/升MgCl25微升；RNA酶抑制劑0.5微升；反轉錄酶0.5微升；Taq酶0.5微升；10微摩爾/升的上游引物1微升；10微摩爾/升的下游引物1微升；總RNA溶解液3.5微升；ddH2O8微升；RTPCR反應程式為：50℃30分鐘；95℃預熱2分鐘；94℃變性40秒，51℃復性30秒，72℃延伸1分鐘，30個循環；72℃延伸10分鐘；
c.電泳分析：取5微升PCR產物進行0.8％瓊脂糖凝膠電泳，而後以凝膠成像系統進行分析，出現特定大小的目的條帶者即判斷為陽性；
（5）毒價計算：統計接種後72小時時雞胚尿囊液PCR檢測呈陽性的雞胚總數，所述雞胚尿囊液源自24～72小時死亡胚和72小時活胚，按照Reed-Muench法計算病毒液或活疫苗的效價；如果孵育24～36小時各稀釋度毒液接種的雞胚均60％以上存活；且計算的病毒效價落在各個稀釋度之間，陽性/陰性比率反映出系列稀釋的效果，檢測結果視為有效。
2.根據權利要求1所述的一種雞傳染性支氣管炎活疫苗效力檢測方法，其特徵是：步驟（1）和步驟（4）中，使用的引物對1設計在雞傳染性支氣管炎病毒基因組保守區N蛋白基因上，擴增目的片段大小為438bp；引物對2設計在雞傳染性支氣管炎病毒S1蛋白基因上，目的片段大小為292bp；引物對3設計在雞傳染性支氣管炎病毒S1蛋白基因上，目的片段大小為635bp。
3.根據權利要求2所述的一種雞傳染性支氣管炎活疫苗效力檢測方法，其特徵是：步驟（2）中，待檢樣品為雞傳染性支氣管炎病毒毒液或活疫苗；若待檢樣品為病毒毒液，直接用無菌生理鹽水或PBS作10倍系列稀釋；若待檢樣品為活疫苗，按瓶簽註明羽份將疫苗用無菌生理鹽水或PBS稀釋成1羽份/0.1毫升，然後作10倍系列稀釋。
4.根據權利要求3所述的一種雞傳染性支氣管炎活疫苗效力檢測方法，其特徵是：步驟（4）中三對引物的RT-PCR反應體系和反應程式相同。
實施方式
實施例所用實驗材料如下：
（1）Trizol（總RNA提取試劑）、一步法RNAPCR試劑盒（One Step RNA PCR Kit（AMV））、6×Loading Buffer均購自寶生物工程（大連）有限公司。
（2）溴化乙錠購自SIGMA公司。
（3）TAE：40毫摩爾/升Tris-乙酸鹽，1毫摩爾/升EDTA。
（4）0.8%瓊脂糖凝膠：將0.8克瓊脂糖溶解於100毫升TAE（瓊脂糖凝膠電泳緩衝液），加熱溶解，冷卻凝固配製而成。
（5））氯仿、異丙醇、乙醇為分析純。
（6）SPF種蛋購自濟南賽斯家禽科技有限公司。
（7）RT-PCR引物如下：
引物對1：F1：5’-GACAAGCAGAGTCTTGT-3’，
R1：5’-GCAACCCACACTATACC-3’
引物對2：F2：5’-AACAAGGTAGTTGTCCATTG-3’，
R2：5’-CCATTAATAAAGTAGGCTAGGGC-3’
引物對3：F3：5’-CAGGTATGGCTTGGTCTAGCAG-3’，
R3：5’-CTGAGCTGTTTGTGTTTGGTAAGT-3’，
引物由北京擎科新業生物技術有限公司合成產品。
實施例1
雞傳染性支氣管炎活疫苗（H120株）效力檢測對比試驗
1、材料
雞傳染性支氣管炎活疫苗（H120株）：瑞普（保定）生物藥業有限公司生產，1000羽份/瓶，批號為140504。
2、方法
（1）病毒稀釋接種及培養
按瓶簽註明羽份將疫苗用無菌生理鹽水稀釋成1羽份/0.1毫升，然後作10倍系列稀釋。取10、10、103個稀釋度，分別經尿囊腔內接種10日齡SPF雞胚，每個稀釋度接種5枚，每胚0.1毫升，同一稀釋度平行接種2組，並設生理鹽水陰性對照，置37℃下繼續孵育。接種後24小時時照蛋1次，棄去死胚。
（2）病毒收穫
第一組：《一種雞傳染性支氣管炎活疫苗效力檢測方法》方法病毒接種後72小時時無菌抽取雞胚尿囊液0.4毫升（包括24～72小時死亡胚和72小時活胚），-20℃保存，標記備用，並保證雞胚正常存活。繼續孵育，至144小時時將剩餘雞胚置於2-8℃中冷卻24小時，氣室向上直立，無菌收集尿囊液（包括24～144小時死亡胚和144小時活胚）於離心管。標記備用。同時對24～144小時死胚及144小時活胚，判定雞胚病變和胎兒稱重。
第二組：雞胚感染法病毒接種後144小時時將雞胚置於2-8℃中冷卻24小時，氣室向上直立。判定雞胚病變和胎兒稱重。
（3）提取總RNA：將第一組兩批待檢尿囊液和對照分別取樣300微升，套用Trizol法提取總RNA，以20微升無RNA酶水溶解，即得總RNA溶解液。
（4）RT-PCR反應
①PCR引物選用引物對1。
②RT-PCR反應
RT-PCR反應體系（25微升）配製如下表1所示：
名稱 | 體積（微升） |
ddH2O | 8 |
10×PCR Buffer | 2.5 |
25毫摩爾/升 MgCl2 | 5 |
dNTP Mixture（10毫摩爾/升 each） | 2.5 |
RNA酶抑制劑 | 0.5 |
反轉錄酶（AMV） | 0.5 |
Tag酶 | 0.5 |
上游引物（10微摩爾/升）+下游引物（10微摩爾/升） | 1+1 |
總RNA溶解液 | 3.5 |
總體積 | 25 |
RT-PCR反應程式為：50℃30分鐘；95℃預熱2分鐘；94℃變性40秒，51℃復性30秒，72℃延伸1分鐘，30個循環；72℃延伸10分鐘。
（5）電泳分析：取5微升PCR產物，加入6×Loading Buffer1微升；DL2000Marker5微升，0.8%瓊脂糖凝膠中進行電泳，凝膠成像系統觀察結果，出現約438bp的目的條帶者即判斷為陽性（該雞胚雞傳染性支氣管炎病毒感染陽性）。
（6）毒價計算：
第一組統計接種後24～72小時的死胚及72小時活胚尿囊液PCR檢測陽性的雞胚總數。如果孵育24～36小時各稀釋度毒液接種的雞胚均60%以上（包括60%）存活，且計算的病毒效價落在各個稀釋度之間，陽性/陰性比率反映出系列稀釋的效果，檢測結果視為有效。按照Reed-Muench法計算病毒液的效價。144小時收穫的尿囊液用類似的方法計算毒價。
第二組根據接種後24～144小時死胚及144小時活胚中，其胎兒具有失水、蜷縮、發育小（接種胎兒比對照最輕胎兒重量低2克以上）等特異性病痕者的總和，按照Reed-Muench法計算EID50。
3、試驗結果
（1）第一組接毒後72小時時PCR凝膠電泳圖見圖1，接毒後144小時時PCR凝膠電泳圖見圖2，統計結果見表2。
稀釋度 | 檢測方法 | 雞胚編號 | 感染比例 | ||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |||
10 | 72小時PCR（+/-） | + | + | + | + | + | 5/5 |
144小時PCR（+/-） | + | + | + | + | + | 5/5 | |
體重（克） | 7.5 | 6.3 | 5.9 | 10.2 | 7.3 | 5/5 | |
10 | 72小時PCR（+/-） | + | - | - | + | - | 2/5 |
144小時PCR（+/-） | + | - | - | + | - | 2/5 | |
體重（克） | 11.0 | 20.9 | 18.5 | 12 | 20.2 | 2/5 | |
10 | 72小時PCR（+/-） | - | - | - | - | - | 0/5 |
144小時PCR（+/-） | - | - | - | - | - | 0/5 | |
體重（克） | 19.8 | 20.5 | 19.1 | 20 | 21 | 0/5 | |
對照 | 72小時PCR（+/-） | - | - | - | - | - | 0/5 |
144小時PCR（+/-） | - | - | - | - | - | 0/5 | |
體重（克） | 22 | 21 | 20.9 | 20.1 | 21.5 | 0/5 | |
EID50 | - | - | - | - | - | - | 10 |
第一組按《一種雞傳染性支氣管炎活疫苗效力檢測方法》方法，病毒接種後72小時取樣測定，計算雞傳染性支氣管炎活疫苗（H120株）效價為10EID50/羽份。病毒接種後144小時取樣測定，計算雞傳染性支氣管炎活疫苗（H120株）效價為10EID50/羽份。
同時對第一組用雞胚感染法判定雞胚病變和胎兒稱重，發現用雞胚感染法判定為感染的雞胚，其PCR檢測結果均為陽性，且一一對應。
（2）第二組雞胚感染法效價測定結果
稀釋度 | 檢測方法（稱重） | 雞胚編號 | 感染比例 | ||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |||
10 | 體重（克） | 6.5 | 7.1 | 7.7 | 10.3 | 8.1 | 5/5 |
10 | 體重（克） | 12.1 | 19.8 | 21.0 | 20.3 | 9.8 | 2/5 |
10 | 體重（克） | 21.3 | 18.9 | 19.5 | 22 | 20.7 | 0/5 |
對照 | 體重（克） | 22 | 21 | 20.9 | 20.1 | 21.5 | 0/5 |
第二組雞胚感染法，接種後24～144小時10稀釋度死亡雞胚4枚，10稀釋度死亡雞胚1枚，死亡胚胚體出血，個體小；144小時活胚中，10稀釋度有1枚雞胚蜷縮成球狀，體重較輕；10稀釋度有1枚雞胚乾縮，爪彎曲，呈抱頭姿勢，體重較輕。以上有死亡、有病變、有體重減輕的雞胚判為感染，計算雞傳染性支氣管炎活疫苗（H120株）效價為10EID50/羽份。
4、結論
（1）標準的雞胚感染法和《一種雞傳染性支氣管炎活疫苗效力檢測方法》方法檢測雞傳染性支氣管炎活疫苗（H120株）效力，結果基本一致；該試驗結果顯示，與常規認識不同，雞傳染性支氣管炎病毒H120株具有在感染導致病變和增殖導致感染兩方面一致性表現的特性。
（2）《一種雞傳染性支氣管炎活疫苗效力檢測方法》方法在病毒接種後72小時和接種後144小時進行PCR檢測，效價一致，均為10EID50/羽份，病毒收穫時間提前到72小時，不影響效價判定的準確性。
實施例2
3對引物對雞傳染性支氣管炎活疫苗（H120株）效力檢測對比試驗
1、材料同實施例1。
2、方法：
按照實施例1第一組的方法，接毒後72小時時無菌收集尿囊液進行檢測。用引物對1、引物對2、引物對3分別對同一尿囊液的總RNA進行RT-PCR檢測。
3、試驗結果
（1）引物對1的檢測結果同實施例1；引物對2的PCR凝膠電泳圖見圖3；引物對3的PCR凝膠電泳圖見圖4。
（2）3對引物效價測定結果見表4。
感染比例/稀釋度 | 10 | 10 | 10 | 效價（EID50） |
引物1 | 5/5 | 2/5 | 0/5 | 10/羽份 |
引物2 | 0/5 | 0/5 | 0/5 | 0 |
引物3 | 5/5 | 2/5 | 0/5 | 10/羽份 |
4、結論
《一種雞傳染性支氣管炎活疫苗效力檢測方法》方法引物對1和引物對3檢測雞傳染性支氣管炎活疫苗（H120株），結果完全一致，效價均為10EID50/羽份，引物對1和引物對3均可用於雞傳染性支氣管炎病毒H120株效價的測定。引物對2檢測樣品均為陰性，疫苗效價為0，不能用於雞傳染性支氣管炎病毒H120株效價的測定。
實施例3
雞傳染性支氣管炎活疫苗（H52株）效力檢測對比試驗
雞傳染性支氣管炎活疫苗（H52株）：瑞普（保定）生物藥業有限公司生產，1000羽份/瓶。
同實施例1、2方法，用標準的雞胚感染法和《一種雞傳染性支氣管炎活疫苗效力檢測方法》方法（3對引物）同時測定雞傳染性支氣管炎活疫苗（H52株）效價。引物對1、引物對3和雞胚感染法檢測結果相一致，均為10EID50/羽份；引物對2檢測效價為0，不能用於雞傳染性支氣管炎病毒H52株效價的測定。
實施例4
雞傳染性支氣管炎病毒M41株病毒液效力檢測對比試驗
雞傳染性支氣管炎病毒M41株，購自中國獸醫藥品監察所。
同實施例1、2方法，用標準的雞胚感染法和《一種雞傳染性支氣管炎活疫苗效力檢測方法》方法（3對引物）同時測定雞傳染性支氣管炎病毒M41株毒液效價。引物對1、引物對3和雞胚感染法檢測結果相一致，均為10EID50/0.1毫升；引物對2檢測效價為0，不能用於雞傳染性支氣管炎病毒M41株效價的測定。
實施例5
雞傳染性支氣管炎活疫苗（W93株）效力檢測對比試驗
雞傳染性支氣管炎活疫苗（W93株）：購自遼寧益康生物股份有限公司，1000羽份/瓶。
同實施例1、2方法，用標準的雞胚感染法和《一種雞傳染性支氣管炎活疫苗效力檢測方法》方法（3對引物）同時測定雞傳染性支氣管炎活疫苗（W93株）效價。引物對1、引物對3和雞胚感染法檢測結果相一致，均為10EID50/羽份；引物對2檢測效價為0，不能用於雞傳染性支氣管炎病毒W93株效價的測定。
實施例6
雞傳染性支氣管炎病毒RP-1株效力檢測對比試驗
1、材料
雞傳染性支氣管炎病毒RP-1株（IBV RP-1株）是瑞普（保定）生物藥業有限公司2010年由河北省某發病雞場分離得到，經分子生物學試驗、血清學試驗等方法，鑑定為雞傳染性支氣管炎病毒，命名為雞傳染性支氣管炎病毒RP-1株，於2014年11月12日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏地址為中國湖北省武漢市武昌區珞珈山，保藏編號CCTCC NO：V201436。
經與Genbank上已發表的雞傳染性支氣管炎病毒4/91（UK）株序列JN192154.1比對，發現IBV RP-1株與IBV4/91（UK）株同源性較高，S1基因核苷酸相似性99.0%以上。根據血清學和氣管環交叉中和試驗證實IBV4/91高免血清對RP-1株有很高的中和指數。研究中發現，IBV RP-1株很少致死雞胚，且雞胚病變不明顯，特徵性侏儒胚較少，套用雞胚感染法測定效價時，病變雞胚數量少且呈現散在不規律分布。
IBV RP-1株F5代毒液接種10日齡SPF雞胚復壯得F6代毒液。
2、方法
（1）病毒稀釋接種及培養
F6代毒液用無菌生理鹽水作10倍系列稀釋，第一組（《一種雞傳染性支氣管炎活疫苗效力檢測方法》方法組）取10、10、103個稀釋度，第二組（雞胚感染法組）取10、10、10、10、10、10、107個稀釋度，分別經尿囊腔內接種10日齡SPF雞胚，每個稀釋度接種5枚，每胚0.1毫升，並設生理鹽水陰性對照，置37℃下繼續孵育。接種後24小時時照蛋1次，棄去死胚。
（2）病毒收穫
第一組：72小時時將雞胚置於2～8℃中冷卻24小時，氣室向上直立。無菌收集尿囊液，標記，-20℃保存備用；
第二組：病毒接種後144小時時將雞胚置於2～8℃中冷卻24小時，氣室向上直立。判定雞胚病變和胎兒稱重。
（3）PCR檢測
同實施例2方法，用引物對1、引物對2、引物對3分別對第一組收穫尿囊液和對照進行PCR檢測。
3、結果
（1）第一組引物對1的PCR凝膠電泳圖見圖5，引物對2的PCR凝膠電泳圖見圖6，引物對3的PCR凝膠電泳圖見圖7。
（2）第二組雞胚感染法檢測結果見表5。
稀釋度 | 檢測方法（稱重） | 雞胚編號 | 感染比例 | ||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |||
10 | 體重（克） | 18.2 | 10.9 | 17.9 | 19.4 | 17.4 | 1/5 |
10 | 體重（克） | 20.17 | 18.9 | 17.6 | 19.0 | 11.5 | 1/5 |
10 | 體重（克） | 11.7 | 19.9 | 18.8 | 12.3 | 16.9 | 2/5 |
10 | 體重（克） | 18.8 | 19.8 | 21.0 | 20.3 | 19.4 | 0/5 |
10 | 體重（克） | 14.1 | 19.0 | 18.9 | 19.2 | 20.4 | 1/5 |
10 | 體重（克） | 18.7 | 19.5 | 20.9 | 19.4 | 19.7 | 0/5 |
10 | 體重（克） | 19.1 | 19.6 | 18.9 | 19.8 | 20.1 | 0/5 |
對照 | 體重（克） | 20.2 | 18 | 17.8 | 20.1 | 19.5 | 0/5 |
第二組雞胚感染法，接種後24～144小時，各稀釋度均無雞胚死亡。144小時活胚中10稀釋度有1枚雞胚表現蜷縮，體重較輕；10稀釋度有1枚雞胚表現肌肉干縮、爪彎曲；10稀釋度有2枚雞胚表現失水，個體小，體重輕；10稀釋度有1枚雞胚表現個體小，體重略輕；其它稀釋度雞胚表現無異常。計算IBV RP-1株毒液效價為10EID50/0.1毫升。
（3）兩組測定效價結果對比見表6
分組 | 稀釋度 | 效價（EID50） | |||||||
10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | |||
第一組 | 引物1 | - | - | - | - | 5/5 | 5/5 | 2/5 | 10/0.1毫升 |
引物2 | - | - | - | - | 5/5 | 5/5 | 2/5 | 10/0.1毫升 | |
引物3 | - | - | - | - | 0/5 | 0/5 | 0/5 | 0 | |
第二組 | - | 1/5 | 1/5 | 2/5 | 0/5 | 1/5 | 0/5 | 0/5 | 10/0.1毫升 |
4、結論
（1）《一種雞傳染性支氣管炎活疫苗效力檢測方法》方法檢測IBV RP-1株效價遠高於雞胚感染法效價。IBV RP-1株致雞胚病變不明顯，病變雞胚數量少且不規律，雞胚感染法檢測結果陽性/陰性比率不能反映出系列稀釋的效果，雞胚感染法不適用於檢測IBV RP-1株。
（2）該發明方法檢測IBV RP-1株，引物對1和引物對2檢測結果一一對應，保持一致，效價測定結果均為10EID50/0.1毫升，引物對1和引物對2均可用於IBV RP-1株效價的測定。引物對3檢測樣品均為陰性，毒液效價為0，不能用於該毒株效價的測定。
實施例7
重複性試驗
套用《一種雞傳染性支氣管炎活疫苗效力檢測方法》方法，對實施例1中雞傳染性支氣管炎活疫苗（H120株）疫苗進行3次重複檢測，3次結果均為10EID50/羽份，重複性較好。
實施例8
3對引物的特異性實驗
1、材料
雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）RP-1株、H120株、H52株、M41株、雞新城疫病毒LaSota株（NDV LaSota株）、禽流感病毒Hp株（AIV Hp株）、雞傳染性法氏囊病毒B87株（IBDV B87株）均由瑞普（保定）生物藥業有限公司種毒室提供，IBVW93株購自遼寧益康生物股份有限公司疫苗。
2、方法
3對引物同時進行，提取總RNA、RT-PCR反應、電泳分析均同實施例1。
3、結果
（1）引物對1特異性試驗結果見圖8；套用引物對1，所有IBV毒株均可擴增出目的條帶，NDV LaSota株、AIV Hp株、IBDV B87株擴增結果均為陰性。
（2）引物對2特異性試驗結果見圖9；套用引物對2，僅IBV RP-1株可擴增出目的條帶，其它擴增結果均為陰性。
（3）引物對3特異性試驗結果見圖10。套用引物對3，IBVH120株、H52株、M41株、W93株可擴增出目的條帶，IBV RP-1株、NDV LaSota株、AIV Hp株、IBDV B87株擴增結果均為陰性。
4、結論
引物對1適合於各型雞傳染性支氣管炎病毒效價的測定，通用性強；引物對2適合於不致雞胚病變的RP-1株效價的測定；引物對3適用於國內常用的疫苗毒株H120株、H52株、M41株、W93株效價的測定，不能用於RP-1株效價的測定。3對引物對其它幾種常見的禽類病毒均檢測陰性，特異性好。
榮譽表彰
2019年9月29日，《一種雞傳染性支氣管炎活疫苗效力檢測方法》獲2018年河北省專利獎優秀獎。
