雞傳染性法氏囊病超強毒的細胞適應株及其套用:專利背景,發明內容,專利目的,技術方案

雞傳染性法氏囊病超強毒的細胞適應株及其套用

《雞傳染性法氏囊病超強毒的細胞適應株及其套用》是中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所於2012年1月17日申請的專利，該專利的申請號為2012100140192，公布號為CN102533673A，授權公布日為2012年7月4日，發明人是王笑梅、高宏雷、祁小樂、高玉龍、秦立廷、王永強。

《雞傳染性法氏囊病超強毒的細胞適應株及其套用》公開了一種雞傳染性法氏囊病超強毒的細胞適應株及其在製備預防雞傳染性法氏囊病藥物中的套用。該發明的細胞適應株為雞傳染性法氏囊病超強毒Gx株的細胞適應株，命名為IBDV-G株，其菌種保藏編號為：CGMCC 5553。將該發明的IBDV-G株滅活後製備成疫苗用於動物的免疫，結果證明：該發明的疫苗安全，且對超強度IBDV-G的致死性攻擊，具有100％的保護率，該發明的超強毒滅活苗抗體陽性率、抗體滴度及對超強毒的保護率，在參與比較的疫苗中，均居於首位。因此，該發明的推廣套用將有效地預防了中國局部地區vvIBD的暴發和流行，有利地促進了免疫地區乃至中國養禽業的持續、穩定、健康地發展。

2018年12月20日，《雞傳染性法氏囊病超強毒的細胞適應株及其套用》獲得第二十屆中國專利優秀獎。

基本介紹

中文名：雞傳染性法氏囊病超強毒的細胞適應株及其套用
公告號：CN102533673A
授權日：2012年7月4日
申請號：2012100140192
申請日：2012年1月17日
申請人：中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所
地址：黑龍江省哈爾濱市南崗區馬端街427號
發明人：王笑梅、高宏雷、祁小樂、高玉龍、秦立廷、王永強
Int.Cl.：C12N7/00(2006.01)I; A61K39/12(2006.01)I; A61P31/14(2006.01)I; C12R1/93(2006.01)N
代理機構：北京科龍寰宇智慧財產權代理有限責任公司
代理人：孫皓晨
類別：發明專利
生物保藏 ：CGMCC No. 5553 2011.12.05

專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,改善效果,附圖說明,技術領域,權利要求,實施方式,榮譽表彰,

專利背景

雞傳染性法氏囊病（IBD）是幼齡雞的一種急性、高度接觸性傳染病。其病原是雞傳染性法氏囊病病毒（IBDV）。IBDV屬雙RNA病毒科，禽雙RNA病毒屬病毒。它有兩個血清型，即血清I型和血清II型。I型毒對雞有致病性，又分為不同亞型，如經典株、變異株、超強毒株和致弱株等。IBDV傾向於侵襲活躍的分離細胞，在雞體內，主要侵害中樞免疫器官-法氏囊中的前體B細胞，使其發生凋亡和壞死，進而使成熟B細胞減少，導致免疫抑制，從而降低機體對其它疫病的易感性和對其它疫苗的反應性。該病現已遍布全球養禽地區，在工業化養禽業發達的國家尤為嚴重。

中國於1979年先後在北京、廣州等地發生該病，初期病死率較低；二十世紀八十年代末、九十年代初，中國開始流行雞傳染性法氏囊病超強毒（vvIBDV），使IBD的發生有了新的變化：病死率升高達100％和60％以上；雛雞易早期感染，急性發病；原有的經典株弱毒苗不能給免疫雞提供完全的保護；帶有較低母源抗體水平的雞群也常常不能抵抗vvIBDV的攻擊。李樹根等發現，TAD（德國）、D78（荷蘭）、BV（美國）、CJ（北京）等弱毒疫苗對由廣東分離的6株血清I型IBDV毒株GF903、GZ902、GN903、GS904、GB905、GD906等的保護率都不高。由於vvIBDV在抗原性上與經典株和經典疫苗株一致，只是在致病性上出現急劇增強的趨勢，理論上講，常規標準血清I型疫苗能夠提供對vvIBDV的保護，但在臨床實踐中，vvIBDV卻能突破母源抗體而感染雛雞。即使不致雛雞死亡，也使法氏囊組織受到嚴重損傷，導致嚴重後果。因此研製出能抵抗國內vvIBDV分離株、免疫原性強、安全性好的疫苗，並將其推廣套用就迫在眉睫。截至2012年1月認為適當提高疫苗的含毒量或選用中毒力疫苗株是提高疫苗免疫效力的兩個好辦法。Vandenberg等證明，D78疫苗免疫接種的規定含量較PBG98疫苗的高10倍，前者抗vvIBDV的效果就比後者好。而中毒力疫苗或殘毒疫苗雖然對IBD的控制效果較好，但不免使人對其毒力和使用後果有些擔心。因此《雞傳染性法氏囊病超強毒的細胞適應株及其套用》發明人認為，分離中國國內vvIBDV，篩選、培育出毒價高，抗原性強的毒株，研製IBD滅活苗，用於雛雞將引起主動免疫，且無毒負作用；用於種雞，將提高子代雞的母源抗體水平，防制早期感染，抵抗中國國內vvIBDV的攻擊。

截至2012年1月，《雞傳染性法氏囊病超強毒的細胞適應株及其套用》發明人將分離到的vvIBDV-Gx株，經過鑑定、篩選、培育，將其5代細胞適應株（IBDV-G）作為種毒，經鑑定後，研製了超強毒滅活疫苗，並進行了一系列實驗室免疫效力試驗、安全性試驗、對中國國內vvIBDV的攻毒保護試驗等，取得了良好的效果。

發明內容

專利目的

《雞傳染性法氏囊病超強毒的細胞適應株及其套用》的目的之一在於提供一種雞傳染性法氏囊病超強毒的細胞適應株。

《雞傳染性法氏囊病超強毒的細胞適應株及其套用》的目的之二在於提供所述的雞傳染性法氏囊病超強毒的細胞適應株在製備預防雞傳染性法氏囊病藥物中的套用。

《雞傳染性法氏囊病超強毒的細胞適應株及其套用》的目的之三在於提供一種預防雞傳染性法氏囊病的疫苗組合物。

技術方案

《雞傳染性法氏囊病超強毒的細胞適應株及其套用》的目的是通過以下技術手段實現的：

《雞傳染性法氏囊病超強毒的細胞適應株及其套用》發明人從廣西某地IBD免疫後發病雞群採取法氏囊組織，經標準化方法處理後，得到IBDV-Gx株。對Gx株進行了致病性試驗，克隆其主要保護性抗原基因VP2，並進行了序列分析和比較。結果表明，其與歐洲標準超強毒UK661的親緣關係較近，主要結構蛋白核苷酸同源性為99％，胺基酸同源性為100％，其對SPF雞胚半數感染量（EID₅₀）為10/0.2毫升，以2×10EID₅₀/只的劑量接種9～11日齡的SPF雞，死亡率達40％，以2×10EID₅₀/只的劑量接種4周齡SPF雞，死亡率達64％。從而證實傳染性法氏囊病病毒Gx為一株符合歐洲超強毒標準和特點的中國國內超強毒株。

對該Gx毒株經SPF雞胚連續傳代5代後，又經SPF雞胚成纖維細胞連續傳代25代，結果表明病毒在細胞上穩定地大量增殖。其中細胞5代毒在接種後72小時，毒價可達4.0×10噬斑/毫升，病毒對SPF雞胚半數感染量（EID₅₀）為10/0.2毫升，以2×10EID₅₀/只的劑量接種4周齡SPF雞，死亡率達60％，進而篩選得到了《雞傳染性法氏囊病超強毒的細胞適應株及其套用》的一種雞傳染性法氏囊病超強毒的細胞適應株，其為雞傳染性法氏囊病超強毒Gx株的細胞適應株，命名為IBDV-G株，分類命名為：雞傳染性法氏囊病毒，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址在北京市朝陽區北辰西路1號院，中科院微生物研究所，其菌種保藏編號為：CGMCCNo.5553，保藏日期為2011年12月5日。

將《雞傳染性法氏囊病超強毒的細胞適應株及其套用》的雞傳染性法氏囊病超強毒的細胞適應株IBDV-G以同步接毒的方式進行批量培養，收穫病毒，經甲醛滅活，以礦物油為佐劑製成油乳劑滅活苗。疫苗接種10日齡及36周齡SPF雞，注苗後均無不良反應。雛雞免疫後7天開始產生抗體，14天時對超強毒IBDV-G（vvIBDV-G）的致死性攻擊，具有100％的保護率。免疫種雞後，28天后直至8-10個月，子代雞均可獲得被動保護，10日齡時對vvIBDV-G的致死性攻擊的保護率為100％，同中國國內外部分同類疫苗進行的比較研究中，該超強毒滅活苗抗體陽性率、抗體滴度及對超強毒的保護率，在參與比較的疫苗中，均居於首位。

因此，《雞傳染性法氏囊病超強毒的細胞適應株及其套用》提出了所述的雞傳染性法氏囊病超強毒的細胞適應株在製備預防雞傳染性法氏囊病藥物中的套用。

《雞傳染性法氏囊病超強毒的細胞適應株及其套用》的一種預防雞傳染性法氏囊病的疫苗組合物，其特徵在於所述的疫苗組合物中，其有效成分包含滅活後的《雞傳染性法氏囊病超強毒的細胞適應株及其套用》所述的雞傳染性法氏囊病超強毒的細胞適應株。

在《雞傳染性法氏囊病超強毒的細胞適應株及其套用》的研究中將致死率作為《雞傳染性法氏囊病超強毒的細胞適應株及其套用》的疫苗免疫保護性的可靠性依據及判定標準。雞傳染性法氏囊超強毒株在中國的出現，使病死率已升高到60～100％，由於vvIBDV在致病性上出現了急劇增強的趨勢，使得傳染性法氏囊病具備了高死亡率的特徵，所以使用嚴重發病及致死率作為免疫保護性指標，可以客觀地評價雞傳染性法氏囊病超強毒滅活疫苗對雞群遭受vvIBDV致死性攻擊時的保護效率，具有極大的可靠性；免疫攻毒保護的雞應臨床不死亡、不發病、無精神沉鬱、食慾廢絕現象。

自1962年Cosgrove首次報導雞傳染性法氏囊病的流行以來，世界各國相繼開展了IBD疫苗免疫方面的研究，油佐劑滅活疫苗具有免疫保護期長、免疫效果確實等優點，截至2012年1月各國使用較多的油佐劑疫苗的毒株包括IBDV的標準毒株和變異株。其對種雞的免疫可將母源免疫力提供給後代，這些母源抗體能保護雞免受早期感染而引起的免疫抑制，世界各國雞傳染性法氏囊病油乳劑滅活苗的研製成功和套用在對傳染性法氏囊病的控制上發揮了巨大的作用。在該研究中將該產品與部分中國國內外同類疫苗，包括已批准的雞傳染性法氏囊滅活苗（CJ-801-BKF株）在內進行了比較，結果表明，該疫苗抗體陽性率、抗體滴度及對超強毒的保護率，在參與比較的疫苗中，居於首位，已批准的CJ-801株雞傳染性法氏囊滅活苗的各項指標與超強毒滅活苗相比基本相同，但超強毒滅活苗有著免疫劑量小（超強毒滅活苗成雞免疫劑量為0.6毫升/只，CJ-801株法氏囊病滅活苗成雞免疫劑量為1.2毫升/只）的明顯優勢，分析其原因，可能是該滅活苗的毒種具有超強毒的特性，同時能在細胞中適應並大量增殖，易於提高疫苗中的抗原量。

採用《雞傳染性法氏囊病超強毒的細胞適應株及其套用》的雞傳染性法氏囊病超強毒的細胞適應株製成的疫苗具有如下優點：

1、《雞傳染性法氏囊病超強毒的細胞適應株及其套用》的一種雞傳染性法氏囊病超強毒的細胞適應株具有超強毒的特性，能在細胞中適應並大量增殖，易於提高疫苗中的抗原量；

2、《雞傳染性法氏囊病超強毒的細胞適應株及其套用》的疫苗組合物其抗體陽性率、抗體滴度及對超強毒的保護率高；

3、《雞傳染性法氏囊病超強毒的細胞適應株及其套用》的超強毒滅活苗有著免疫劑量小（超強毒滅活苗成雞免疫劑量為0.6毫升/只，CJ-801株法氏囊病滅活苗成雞免疫劑量為1.2毫升/只）的明顯優勢；

4、研究結果表明，雞傳染性法氏囊病超強毒滅活苗具有免疫原性好、免疫保護持續期長、免疫劑量小等優點。

IBDV流行與分布較廣，加之病毒本身對外界抵抗力較強，感染舍的徹底消毒也十分困難，因此使用能夠抵抗中國國內vvIBDV流行的高效疫苗對易感雞群進行免疫預防，減少甚至避免其對養禽業造成的危害勢在必行。該研究結果表明，雞傳染性法氏囊病超強毒滅活苗具有免疫原性好、免疫保護持續期長、免疫劑量小等優點，它的的推廣套用將有效地預防了中國局部地區vvIBD的暴發和流行，給免疫場帶來了明顯的經濟效益和社會效益，有利地促進了免疫地區乃至中國養禽業的持續、穩定、健康地發展。

附圖說明

圖1為IBDV-G在CEF上的生長曲線；

圖2為種毒IBDV-G的電鏡照片。

技術領域

《雞傳染性法氏囊病超強毒的細胞適應株及其套用》涉及一種超強毒株的細胞適應株及其套用，特別涉及一種雞傳染性法氏囊病超強毒的細胞適應株及其在製備預防雞傳染性法氏囊病藥物中的套用。屬於生物疫苗領域。

權利要求

1.雞傳染性法氏囊病超強毒的細胞適應株，其特徵在於所述的細胞適應株為雞傳染性法氏囊病超強毒Gx株的細胞適應株，命名為IBDV-G株，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其菌種保藏編號為：CGMCCNo.5553。

2.權利要求1所述的雞傳染性法氏囊病超強毒的細胞適應株在製備預防雞傳染性法氏囊病藥物中的套用。

3.一種預防雞傳染性法氏囊病的疫苗組合物，其特徵在於所述的疫苗組合物中，其有效成分包含滅活後的權利要求1所述的雞傳染性法氏囊病超強毒的細胞適應株。

實施方式

實施例1 雞傳染性法氏囊病超強毒滅活苗制苗用種毒IBDV-G的鑑定

1、材料和方法

1.1疫苗用種毒的鑑定

1.1.1種毒的培養及毒價測定

以10日齡SPF雞胚製備雞胚成纖維細胞，以同步接毒方式接種5代細胞毒，即《雞傳染性法氏囊病超強毒的細胞適應株及其套用》的雞傳染性法氏囊病超強毒的細胞適應株IBDV-G，37℃培養。不同時間收集病毒培養物，以病毒蝕斑形成方法測定病毒含量，繪製病毒生長曲線，並確定收毒時間和種毒毒價。

1.1.2電鏡觀察

種毒細胞培養物凍融後，直接負染法做電鏡觀察；經不連續蔗糖梯度離心純化後，抽取40％蔗糖段的病毒帶，加PBS超速離心（27000轉每分，2.5小時），少量TNE懸浮後，直接負染法做電鏡觀察。

1.1.3外源病毒檢查

IBDV-G培養物，稀釋至1×10噬斑/毫升，將其與超強毒IBDV-G單特異血清等量混合併經37℃1小時中和後，取10日齡SPF雞20隻，以滴鼻、點眼的途徑進行接種，每隻雞接種0.2毫升（1.0×10噬斑/只），20天后，採集血清，分別使用血凝抑制（HI）、瓊擴（AGP）、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）、中和試驗（VN）、免疫螢光（IFA）等方法，檢測血清中雞傳染性法氏囊病病毒（IBDV）、雞馬立克病毒（MDV）、雞新城疫病毒（NDV）、禽網狀內皮組織增殖征病毒（REV）、雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）、禽流感病毒（AIV）、禽白血病病毒（LLV）、雞傳染性喉氣管炎病毒（LTV）、禽腦脊髓炎病毒（AEV）、雞痘病毒（POX）的抗體陽性率。