RT-PCR技術

RT—PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）是將RNA的反轉錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈式擴增（PCR）相結合的技術。首先經反轉錄酶的作用，從RNA合成cDNA，再以cDNA為模板，在DNA聚合酶作用下擴增合成目的片段。RT—PCR技術靈敏而且用途廣泛，可用於檢測細胞中基因表達水平、細胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉錄的RNA產物。無論使用何種RNA，關鍵是確保RNA中無RNA酶和基因組DNA的污染。用於反轉錄的引物可視實驗的具體情況選擇隨機引物、Oligo dT及基因特異性引物中的一種。對於短的不具有髮夾結構的真核細胞mRNA，3種都可。

基本介紹

• 中文名：RT-PCR技術
• 外文名：Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction
• 特點：靈敏而且用途廣泛
• 套用：檢測細胞組織中基因表達水平

操作步驟

1、從RNA（或mRNA）反轉錄合成cDNA第一鏈：

RT-PCR反應原理

2、於95℃加熱5～10min，滅活反轉錄酶，使RNA—cDNA雜交體變性，然後迅速冰浴冷卻：

3、PCR擴增：方法基本同PCR。

cDNA第一鏈合成方法：20ul反應液中含10xPCR擴增緩衝液，2ul；四種dNTP（10 mmol/L）2ul；RNA酶抑制劑20U；mRNA，l～2ug（或RNA 5-10ug）；AMV，20U；引物，1u；最後用滅菌水補至20ul。 以上溶液充分混勻後，於42℃反應60min，反應完畢後將反應管在95℃下加熱5min，使反轉錄酶失活和RNA—cDNA雜合物變性。其後反應液則可置於-20℃下保存備用。

注意事項

1、合成cDNA的引物：合成cDNA引物時，通常採用隨機六核苷酸引物能夠有效地指導從RNA有效地合成第一鏈cDNA：

2、避免RNA酶的污染：在合成cDNA第一鏈時，應使用RNA酶抑制劑，進行RT-PCR時，用於合成cDNA第一鏈的RNA不會對PCR有影響，因此沒有必要用鹼或RNA酶處理；

3、不同來源的逆轉錄酶均可較好地用於第一鏈cDNA的合成，但不同來源的逆轉錄酶反應溫度有所不同。如來自鳥類成髓細胞瘤病毒（AMV）與來自鼠白血病毒莫勒尼株（Mo-MLV）均可用於合成第一鏈cDNA，AMV要求的反轉錄溫度為42℃，而Mo-MLV則要求37℃，相對而言，Mo-MLV比較適合於RT-PCR，但由於其作用的最適溫度為37℃，較AMV的42℃低，因此，對於具有較高二級結構的RNA模板可能會帶來不利的影響。

影響因素

（一）組織或細胞樣本

不是每種組織或細胞都表達所有的基因，即某些基因的mRNA不存在於某些組織或細胞中。因此，確定所選用的材料中是否含有需擴增的目標mRNA模板是實驗成敗的關鍵。

（二）引物

合成cDNA第一條鏈時，引物可用隨機6聚核苷酸，或下游引物，或poly（dT），其中以6聚核苷酸的隨機引物效果最好。

（三）反轉錄酶

不同來源的反轉錄酶均可較好地用於第一鏈cDNA的合成，其合成受不同RNA模板的影響。提高反轉錄溫度（55℃）、增加1～3倍的酶量可克服RNA二級結構的影響。

（四）cDNA反應產物

合成eDNA第一鏈所用的RNA模板不影響PCR反應，無需用鹼或RNase處理去除。另外，沒有必要將cDNA反應產物全部用於PCR，用其1/25～1/10即可。

（五）RNA酶污染

避免RNA酶污染是RT—PCR成功的關鍵之一。用於RNA操作的各種器皿，包括Eppen—dorf管、Tip頭等，都應該用RNA酶抑制劑處理，試劑應該用RNase—free水配製。使用的全部器皿和耐高壓的試劑都必須經高壓滅菌處理。在操作全過程中，操作者都應該戴一次性手套和口罩，以防污染。