RTPCR

RTPCR，反轉錄·聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR）是將RNA的反轉錄（reverse transcription ）和cDNA的聚合酶鏈式擴增（PCR）相結合的技術。

基本介紹

• 中文名：反轉錄·聚合酶鏈反應
• 外文名：reverse transcription-polymerase chain reaction
• 英文縮寫：RTPCR
• 所屬學科：生物

RT-PCR簡介

首先經反轉錄酶的作用從RNA合成 cDNA，再以cDNA為模板，擴增合成目的片段。RT-PCR技術靈敏而且用途廣泛，可用於檢測細胞中基因表達水平，細胞中RNA病毒的含量和直接克隆 特定基因的cDNA序列。作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉錄的RNA產物。無論使用何種RNA，關鍵是確保RNA中無RNA酶和基因組 DNA的污染。

提取組織或細胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，採用Oligo（dT）或隨機引物利用反轉錄酶反轉錄成cDNA。再以cDNA為模板經行PCR擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達。

過程

RT-PCR可以用一步法或兩步法的形式進行。在兩步法RT-PCR中，每一步都在最佳條件下進行。cDNA的合成首先在反轉錄緩衝液中進行，然後取出1/10的反應產物進行PCR。在一步法RT-PCR中，在同時為反轉錄和PCR最佳化的條件下，反轉錄和PCR順次進行。

1、反轉錄酶的選擇1、Money 鼠白血病病毒反轉錄酶

兩種方法

有較強的聚合酶活性，RNA酶H活性相對較弱。最適作用溫度為37°。

2、AMV反轉錄酶

有強的聚合酶活性和RNA酶H活性。最適溫度為42°。

2、合成cDNA引物的選擇

用於反轉錄的引物可視實驗的具體情況選擇隨機引物、Oligo dT 及基因特異性引物中的一種。對於短的不具有發卡結構的真核細胞mRNA，三種都可。RT-PCR引物的選擇：

一步法

1. 隨機引物 適用於長的或具有發卡結構的RNA。適用於rRNA、mRNA、tRNA 等所有RNA的反轉錄反應。主要用於單一模板的RT-PCR反應。

2. Oligo dT 適用於具有PolyA尾巴的RNA。（原核生物的RNA、真核生物的rRNA和tRNA不具有PolyA尾巴。）由於Oligo dT要結合到PolyA 尾巴上，所以對RNA樣品的質量要求較高，即使有少量降解也 會使全長cDNA合成量大大減少。

兩步法

3. 基因特異性引物 與模板序列互補的引物，適用於目的序列已知的情況。

影響因素

RT-PCR反應受多個因素影響，如硫酸鎂的濃度, 引物退火的溫度，擴增的循環數等。

1、建議選擇0.5-3.0 mM (相差0.5 mM)的硫酸鎂作初步實驗。

2、對於具有較高Tm的引物，增加退火和延伸時的溫度對反應有利。較高的溫度有利於減少非特異的引物結合，因而提高特異產物的得率。

3、大多數目標RNA經40輪PCR反應就能觀察到。但如果目標RNA太稀少，或者只有很少的起始材料，有必要增加擴增的次數到45-50次。