初乳關鍵免疫活性蛋白,母乳中重要的活性成分,母乳中含量豐富,嬰兒臍帶血及血漿中含量豐富,對嬰兒早期發育的作用,免疫保護,OPN配方餵養兒細胞因子更接近母乳餵養兒,腸道健康保護,大腦髓鞘形成與認知發育,添加OPN的配方奶粉,人乳中OPN含量遠高於牛乳,人乳OPN和牛乳OPN主要功能結構相似,未強化OPN配方奶OPN含量低,生物學機制,OPN的作用機制,OPN在不同器官、系統中的作用,OPN活性蛋白的提取,
初乳關鍵免疫活性蛋白
母乳中重要的活性成分
OPN是母乳中重要的活性物質,具有調節免疫、促進腸道發育等多種生物學意義,是嬰兒早期發育重要的營養支持。
母乳活性成分是指天然存在於母乳中的,具有生物學效應的成分,比如以
免疫球蛋白、OPN活性蛋白、溶菌酶、脂肪球膜蛋白為代表的活性蛋白類,還包括
細胞因子、生長因子寡聚糖、
益生菌、OPO、
gsMO、a-lac等成分。
母乳活性成分具有促進新生嬰兒組織器官發育成熟、調節免疫功能、促進生長發育等多種功能,是母乳餵養促進母嬰健康的重要因素。嬰兒配方粉中添加母乳活性成分,可以模擬母乳的生物學作用,使配方奶的餵養效果更加接近母乳。
OPN(OPN活性蛋白)是母乳活性成分中的重要成員,有促進腸道發育,增強腸道屏障保護功能,調節免疫,促進認知發育等作用。
母乳中含量豐富
OPN最初發現於骨骼中,隨後發現體內多種組織細胞均可合成與分泌。OPN廣泛分布於包括骨骼、牙齒、腎、腦、肌肉、軟骨、膀胱在內的多種組織和巨噬細胞、自然殺傷細胞、血管平滑肌細胞中,在乳汁和血漿中也有發現,其中,乳汁,尤其是初乳中OPN的含量最高,隨著哺乳時間的延長,其濃度逐漸下降。
在對中國和日本哺乳媽媽乳汁OPN含量的研究中發現,隨著嬰兒周齡的增加,母乳中OPN的含量都表現出了逐漸下降的趨勢。
不同國家、不同個體母乳中OPN含量和在總蛋白中的比例均不同,其原因可能與基因、哺乳母親的飲食習慣和環境有關。2018年的研究發現,中國哺乳母親的乳汁中OPN含量(266.2mg/L),明顯高於韓國(216.2mg/L)、日本(185mg/L)和丹麥(99.7mg/L)。
中國哺乳母親的乳汁中OPN在總蛋白中的比例(2.7%),也高於韓國(1.8%)、日本(2.4%)和丹麥(1.3%)。
嬰兒臍帶血及血漿中含量豐富
OPN存在於大多數組織和體液中,研究人員不僅檢測了母乳、牛乳中OPN的濃度,還對臍帶血、3月齡嬰兒、孕婦和非孕婦成人的血漿樣本進行了檢測[9]。
檢測結果發現,3月齡嬰兒血漿和臍帶血血漿中的OPN濃度分別為342 ng / mL和263 ng / mL ,成人血漿中OPN的濃度為35 ng / mL[9]。
3月齡嬰兒血漿和臍帶血血漿中的OPN水平是成人的7至10倍。臍帶血和小嬰兒血漿中高濃度的OPN水平提示OPN對嬰兒生命早期的健康和生物學作用非常重要[9]。
對嬰兒早期發育的作用
免疫保護
OPN在免疫保護方面包含兩個方面
腸道免疫。OPN活性蛋白可直達腸道,幾乎不會被胃酸破壞,通過促進腸道發育的方式,增強腸道免疫,減少胃腸道疾病,比如壞死性小腸結腸炎,為生命早期提供免疫保護。
全身免疫。OPN可以促進敗血症引起的急性肺損傷中的嗜中性粒細胞遷移;同時也被證明可以調節巨噬細胞功能,包括增殖、遷移、激活、吞噬,促進炎細胞因子產生和抑制一氧化氮合成;OPN還是樹突狀細胞的生存因子,可以促進其成熟和發揮作用。另外,OPN還可調節Th1和Th2的產生,促進T細胞遷移以及極化等方面起重要作用
OPN配方奶餵養兒發熱減少
一項隨機、對照研究發現,0-6月齡內OPN配方奶餵養兒發熱情況顯著更低,減少幅度可達50%。另外雖然呼吸道疾病和胃腸道疾病的發病率沒有區別,但OPN配方奶餵養兒(F65,F130組)的呼吸道和胃腸道問題少於不含OPN的普通配方奶餵養兒(F0組),可能是OPN組餵養兒發熱明顯少的因素。
另外,雖然沒有得出統計學意義,但根據父母的反饋,OPN配方奶餵養兒哭鬧和失眠的發生也比普通奶粉餵養兒更少。
OPN配方餵養兒細胞因子更接近母乳餵養兒
細胞因子是重要的生理信號分子,影響免疫系統發育。OPN對嬰兒免疫系統的影響還表現為顯著降低血漿促炎性細胞因子水平。
研究發現,添加OPN的嬰兒配方奶餵養兒細胞因子反應與母乳餵養兒更接近。與普通配方奶粉嬰兒相比,OPN配方奶嬰兒血清腫瘤壞死因子α水平顯著降低。另外,OPN配方餵養嬰兒的IL-12的濃度,比普通餵養組更接近母乳餵養組嬰兒的水平。
腸道健康保護
OPN大部分可以耐受消化酶、胃酸的分解,以完整的形式進入腸道被吸收,參與胃腸道發育的過程,對嬰兒腸道發育成熟、腸道免疫建立都有非常重要的意義。
母乳活性成分,OPN活性直達嬰兒腸道
對乳蛋白成分體外消化生物學試驗中發現,人乳OPN在通過pH值4.0甚至更高酸度的模擬胃液時,大部分OPN可以完整的通過,進入腸道,只有分子量為34和23 kDa的OPN片段會被胃蛋白酶輕微降解。
母乳中的OPN進入腸道後,完整或部分完整的OPN和OPN多肽可以與腸上皮細胞的多種整合素和CD44受體結合或直接被消化吸收,進入循環系統到達靶細胞後激活信號傳導通路,進而發揮多種作用。
OPN可以通過腸壁被吸收
生物素醯化的牛乳OPN(b-OPN)溶於飲用水,20μg/ml,給與野生型小鼠飲下,8天后在外周血中未檢測到b-OPN。
用灌胃的方式給與野生型小鼠20 μg/ml或200 μg/ml OPN,均在外周血中檢測到OPN,濃度分別為~145 和 ~1050 ng/ml,顯著高於飲用水口服給與OPN組的野生小鼠( P<0.001)。
OPN通過多種途徑參與腸道發育
為評估b-OPN(牛乳OPN)對腸道發育的影響,研究者對新生恆河猴進行了研究。將新生恆河猴(16隻)進行隨機分組:母乳餵養組(4隻),配方奶粉餵養(FF,6隻),添加了牛乳OPN的配方奶餵養組(b-OPN,6隻),餵養3個月後提取空腸mRNA進行微陣列分析。
研究發現,母乳餵養和FF組之間差異表達1017個基因,母乳餵養和b-OPN組之間差異表達217個基因,FF和b-OPN組之間119個基因差異表達。近50%的探針組位於中間模組中,該該探針組的平均表達,普通配方組(FF)低於母乳組(BF),OPN配方組( b-OPN)介於兩者之間。
該模組豐富了與細胞粘附和運動,細胞骨架重塑,無翼和整合位點信號以及神經元發育相關的基因。這些經典途徑主要集中在整合蛋白上,它們是OPN的受體。母乳餵養的猴子和FF猴子的腸道轉錄組不同,但是與人乳相似水平的牛OPN會改變基因表達譜。從這個方面上,b-OPN組的猴子與母乳餵養的猴子更加相似。
OPN減少胃腸道疾病
為研究OPN對胃腸道的作用,研究者用鼠進行模擬胃腸疾病的實驗。將實驗小鼠分為4組:對照組(不處理),實驗組1(DSS處理,對照),實驗組2(DSS處理+重組OPNμg/ml),實驗組3(DSS+乳汁OPNμg/ml)。DSS處理是指給予葡聚糖硫酸鈉(DSS)溶於無菌蒸餾水7天,誘導實驗性結腸炎。
研究發現,與未給與OPN的DSS組比較,給與乳汁OPN組可以顯著減少結腸炎臨床症狀(p<0.05)。與給與重組OPN(r-OPN)比較,給與乳汁OPN組可以顯著減少結腸炎臨床症狀(p<0.05)。表現為,給與乳汁OPN組的小鼠體重下降減少、結腸縮短和脾臟腫脹降低,疾病活動指數降低,改善紅細胞計數並降低腸道中中性粒細胞活性,促炎介質的水平降低。
這項研究表明,在飲用水中施用生理濃度的牛奶OPN可以改善DSS誘發的急性結腸炎的破壞性宿主反應。
OPN降低壞死性小腸結腸炎的嚴重程度
研究人員通過實驗對早產仔豬進行了研究。將26隻早產仔豬隨機分為兩組,均進行2天的場外營養(PN)和1.5天的腸飼期,對照組:不含OPN配方;OPN組:在PN期間每隔三小時給與含OPN(2g/l)的去離子水5 ml/kg,在腸飼期間給與富含OPN(2.2 g/l)的配方奶。
研究結果顯示,OPN配方奶顯著降低早產仔豬NEC嚴重程度(P<0·01),並且有降低NEC發生率的趨勢。
大腦髓鞘形成與認知發育
OPN在人乳中含量很高,除了對嬰兒腸道發育、
免疫調節、
細胞增殖和分化有重要的生物學效應外,OPN還與認知發育有關。從研究來看,OPN可以通過促進神經細胞髓鞘化促進神經系統發育。
在Rulan Jiang等人的動物實驗研究中,OPN陽性組(餵養含高濃度OPN正常母乳的野生型鼠仔)產後6天和8天時大腦OPN水平顯著高於OPN陰性組(餵養不含OPN母乳的OPN敲除鼠仔)。此外,OPN陽性組小鼠髓鞘鹼性蛋白和髓磷脂相關糖蛋白的表達水平更高,通過避暗實驗和疲勞轉棒實驗顯示,OPN陽性組小鼠的學習能力更強。
髓鞘是包裹在神經細胞軸突外面的一層膜,即髓鞘由施旺細胞和髓鞘細胞膜組成。髓鞘化使神經興奮在沿神經纖維傳導時速度加快,並保證其定向傳導,是新生兒神經系統發展必不可少的過程,也是神經系統發育的重要標誌。
OPN促進認知發育的機制為促進髓鞘的形成,OPN可以通過上調大腦中OPN水平促進髓鞘形成而可能在早期大腦發育中發揮重要作用。
添加OPN的配方奶粉
因為人乳和牛乳中OPN含量的巨大差異(OPN在母乳中含量可高達138mg/L,明顯高於牛乳和配方奶粉中的OPN含量18mg/L),未添加OPN的嬰兒奶粉中OPN含量非常少。添加OPN的嬰兒配方奶與未添加了OPN的配方奶相比在嬰兒免疫、減少發熱等方面的表現更接近母乳餵養兒。
人乳中OPN含量遠高於牛乳
牛乳與人乳中的OPN含量差別很大,不同媽媽乳汁中OPN的含量差別也非常大。
不同國家、個體人乳中OPN的含量差別雖然非常大,但人乳OPN平均濃度(138mg/L)明顯高於牛乳OPN含量(平均18mg/L)。所測OPN包含了完整的OPN(>80%)和裂解的OPN的天然混合物。
在丹麥的一項研究中,檢測了29名丹麥女性乳汁中的OPN濃度,檢測結果發現,不同女性乳汁OPN濃度相差非常大,OPN濃度範圍在18-322mg/L,平均濃度為138 mg/L ,約占乳汁中總蛋白含量的2.1%,遠高於牛乳中的OPN濃度18 mg/L。
人乳OPN和牛乳OPN主要功能結構相似
OPN是含有特殊結構序列
谷氨酸-
甘氨酸-
天冬氨酸(Arg-Gly-Asp,RGD)的高度磷酸化的糖蛋白,OPN的糖基化修飾以O-聚糖為主,其中唾液酸化比例高,因此也可稱為唾液酸糖蛋白[4]。人OPN約含314個胺基酸殘基,分子量約44kDa,大小取決於其翻譯後的修飾程度(磷酸化和糖基化)[1]。來源於小鼠、大鼠、牛、豬、兔和雞的OPN,分別含294個胺基酸(aa)、318aa、278aa、303aa、311aa和264aa,aa同源性為35%~86%。
人乳和牛乳中的OPN主要功能結構相似。人乳OPN 包含有298胺基酸,牛乳OPN 是262個胺基酸,其中182個胺基酸相同,另外44個殘基結構具有高度相似性,約90%胺基酸序列高度相似。
人乳OPN磷酸化程度僅略高於牛乳(36 vs 28),約25個磷酸化位點和3個O-糖基化位點相同,有相同RGD序列以及水解位點。
未強化OPN配方奶OPN含量低
OPN在母乳中含量明顯高於牛乳和配方奶粉中的OPN含量(牛乳:18mg/L;母乳:138 mg/L),未強化OPN的嬰兒配方奶中,OPN含量很低 [9],有必要強化配方奶中的OPN含量,使其更接近母乳。嬰兒配方食品中補充OPN可以有更多的健康益處[6],且外源性補充OPN可以增加血漿中的內源性OPN的產生,促使其進一步發揮有益作用。
研究人員為了解普通奶粉餵養兒與OPN強化奶粉餵養兒之間的差別,進行了一項隨機臨床試驗。
在這項研究中,研究人員招募了已經決定不進行
母乳餵養的1-6月齡健康足月嬰兒240名(120名男孩,120名女孩),另外還招募了決定純母乳餵養的健康足月兒80名(40名男孩,40名女孩)。
研究人員將入組的嬰兒一共分為四組:純母乳餵養組(BF),不含OPN的普通奶粉餵養組(F0),含有牛乳OPN 65 mg/L的配方組(F65)和含有牛乳OPN 130 mg/L的配方組(F130)。
從入組開始給嬰兒餵養所在組的配方粉,在研究對象1月齡,4月齡,6月齡時分別採集血液標本,分析嬰兒血液學,血清細胞因子等情況,研究結果如下:
研究發現,含OPN 130 mg/L的配方奶餵養兒(F130組),血漿蘇氨酸濃度顯著低於普通配方奶餵養兒(F0組)和含OPN 65 mg/L的配方奶餵養兒(F65組);F130組嬰兒血漿纈氨酸,支鏈胺基酸(BCAAs)濃度顯著低於F0組,F130組嬰兒血漿胺基酸水平與母乳餵養組更接近。提示富含OPN的嬰兒配方奶可改善胺基酸代謝。
富含OPN的嬰兒配方奶減少嬰兒發熱
研究發現,在配方奶餵養組中,不含OPN的普通配方(F0組)組的發熱天數和發燒率明顯高於OPN餵養組(F65,F130),但F65組和F130組之間沒有顯著差異。
F65組和F130組在胃腸道疾病和呼吸道疾病發病率上沒有顯著差異,但F130組的患病率是低於F0組的,表明OPN下調了炎性細胞因子TNF-α水平,從而影響了免疫功能。
富含OPN的嬰兒配方奶降低血漿促炎性細胞因子水平
研究發現,添加OPN的嬰兒配方奶餵養兒細胞因子反應與母乳餵養兒更接近。與普通配方奶粉嬰兒F0組相比,F65,F130組嬰兒血清腫瘤壞死因子α水平顯著降低,從而減少促炎信號,減少發熱和促炎性免疫應答。
BF組嬰兒中IL-12的濃度比F0高32%,而F65組和F130組嬰兒的IL-12的濃度在BF和F0之間。IL-12由活化的抗原呈遞細胞(樹突狀細胞,巨噬細胞)產生,它促進TH1反應的發展,是T細胞和NK細胞產生IFNg(干擾素)的有力誘導劑,IL-12在宿主防禦中至關重要,尤其在針對細胞內細菌感染的防護中。
富含OPN的嬰兒配方奶增加外周T細胞和單核細胞比例
研究發現,母乳餵養會影響免疫細胞的組成和個體發育,而配方奶中添加生物活性OPN可能會增加T細胞和單核細胞的比例,而且,這種作用似乎是劑量依賴性的。
含OPN 130 mg/L的配方奶餵養兒(F130組),外周血T細胞比例顯著高於標準配方奶餵養兒(F0組)和含OPN 65 mg/L的配方奶餵養兒(F65組)。
富含OPN的嬰兒配方奶安全性良好
與普通配方組嬰兒比較,OPN配方組嬰兒(F65,F130)在配方奶攝入量,身長、體重、頭圍Z評分,嬰兒睡眠狀況、不良反應方面沒有差異性,安全性良好。
純母乳餵養組嬰兒較配方奶餵養組(F0,F65,F130)嬰兒體重較高、頭圍較大,睡眠較少。
綜合以上結果,嬰兒奶粉中添加OPN具有良好的耐受性,嬰兒生長發育正常,在嬰兒配方奶粉中添加OPN,使其濃度為人乳相似或為人乳粉的一半,可以減少發燒(疾病)和促炎性免疫應答(細胞因子分布),提升寶寶的全身免疫力,使其更接近母乳的餵養效果。
生物學機制
OPN的作用機制
OPN活性蛋白是高度磷酸化的糖蛋白,人體OPN約含314個胺基酸殘基,分子量約44kDa,大小取決於其翻譯後的修飾程度(磷酸化和糖基化)。磷酸化參與翻譯後修飾,對OPN生物活性發揮重要作用,如抑制血管鈣化,結合OPN受體( αvβ3整合素)等。高度磷酸化使OPN帶大量負電荷,易於與帶正電荷的乳鐵蛋白形成複合物。人乳OPN的5個糖基化位點在細胞粘附活性中發揮重要作用。OPN在Th1型免疫反應中發揮關鍵作用,人乳OPN通過提高Th1反應,增強抵抗力。
OPN作為一種細胞因子,可與多種物質結合,通過激活細胞內特異性信號傳導系統而介導細胞粘附、遷移和增殖等,發揮細胞信號分子作用。其作用機制包括以下幾個方面:
(1)多種
整合素受體。αvβ1 、αvβ3 、αvβ5 、α5β1 、α8β1 、α4β1和α9β1 等多種整合素能與OPN 結合。2 個α4β1 整合素結合部位位於OPN 的N-末端凝血酶片酸的38 aa結構域上,α9β1 能結合凝血酶斷裂的OPN N-末端上新型識別序列SVVYGLR。
(2)細胞表面黏附性糖蛋白CD44。CD44變異體(CD44v )以非RGD序列結合OPN 的C 末端和N 末端結構域,在瓣膜間質細胞中,OPN與CD44v6結合,可通過磷酸化AKT介導鈣沉積。
(3)補體H因子。OPN 能以高親和力結合H 因子, 調節補體活性。
(4)胰島素樣生長因子結合蛋白-5(IGFBP-5)。OPN可以與胰島素樣生長因子結合蛋白-5(IGFBP-5)結合。
(5)其它機制。羥基磷灰石(HA)、纖連蛋白(FN)、Ⅰ型膠原和骨鈣蛋白都能與OPN結合。非磷酸化OPN(np69)能與可溶性FN 形成免疫複合物, 而磷酸化OPN(pp69)能結合細胞表面相關的FN。
OPN在不同器官、系統中的作用
OPN參與機體多種生理和病例過程。在正常組織中,OPN主要在骨和上皮細胞表面表達; 在病理過程中,OPN在損傷和發炎的上皮細胞、血管內皮細胞、平滑肌細胞和某些腫瘤細胞、涉及炎症浸潤的T細胞和巨噬細胞內高度表達,參與血管生成,炎症,細胞凋亡,傷口癒合,腫瘤轉移等。
(1)OPN與骨。OPN是成骨細胞的表型之一,在骨基質的礦化和吸收過程中起重要作用。
(2)OPN與心血管系統。OPN 是血管平滑肌由收縮表型向合成表型轉化的標誌基因,與動脈粥樣硬化斑塊的鈣化密切相關,在心血管特別是血管重塑過程中起重要調節作用。
(3)OPN與腫瘤。OPN參與細胞的炎症反應,促進細胞遷移、粘附及相關信號轉導,調節與腫瘤發生、發展相關基因的表達,促進細胞外基質的降解,抑制機體對腫瘤的免疫作用,加速腫瘤的進展。
(4)OPN與免疫系統。OPN 被描述為早期 T 細胞活化基因 1(Eta-1),在對抗感染的非特異性免疫及自身免疫中起一定作用,對巨噬細胞有化學誘導的作用等。
(5)OPN與消化系統。有OPN 分布與表達的消化器官和組織有:胃,小腸,闌尾,大腸,膽囊 上皮,肝內膽管,胰腺,唾液腺管和唾液腺黏液細胞。 膽囊中OPN 可能與粘蛋白類 似的特性與結石的形成有關。
(6)OPN與泌尿系統。腎小管細胞和腎乳頭表面細胞均可分泌OPN,正常人尿中OPN的濃度為 6×10-8mol/L,足以抑制草酸鈣結晶,其在尿中濃度可以反映尿抑制結石形成的能力。
OPN活性蛋白的提取
食品中所添加的OPN來自於新鮮牛乳,經過一系列的分離、純化技術,包括離子交換層析(DE—AE—Sephacel)、疏水層析(Phenyl—Sepharose層析),再經濃縮、冷凍乾燥後,提取出OPN凍乾粉。根據所用奶源中OPN含量不同,採用儀器設備和提取純度不同,有報導從2L原料奶中可以提前大約19mgOPN凍乾粉,也有報導稱從1L原料奶中可以提取大約11mg的OPN,按照這樣的提取量來計算,約90噸牛乳中才能提取1公斤的OPN,非常珍貴。根據兩者在牛乳中的含量對比,提取同等重量OPN所需牛乳量是
乳鐵蛋白的5倍。