基本介紹
基本信息,分類和功用,結構及表達,產物及功能,人類腫瘤,臨床意義,論文,討論,結果,材料,方法,
基本信息
myc基因首次在Burkitt淋巴瘤中發現，可通過染色體易位而活化，最常見的是通過8號染色體與14號染色體間易位，使得8號染色體上的myc基因或其相鄰區域與14號染色體的免疫球蛋白重鏈融合而被活化。myc基因還可以通過染色體2：8或8：22間易位與免疫球蛋白輕鏈序列融合而被活化。儘管不同腫瘤中影響myc基因的易位斷裂點的具體位置可能有所不同，但染色體易位的共通之處是改變了myc基因正常的表達調控機制。
分類和功用
myc基因包括C - myc，N -myc，L - myc，分別定位於8號染色體，2號染色體和1號染色體。結構上由不編碼蛋白質的第1外顯子和編碼蛋白質的第2，3外顯子構成。myc基因屬於編碼核蛋白的癌基因，3個基因都編碼一種與細胞周期調控有關的核內DNA結合蛋白。myc基因家族及其產物可促進細胞增殖，永生化，去分化和轉化等，在多種腫瘤形成過程中處於重要地位。myc基因家族中的3個成員對腫瘤形成及在腫瘤類型方面存在差異。認為，C - myc的擴增與腫瘤發生與轉歸密切相關，N - myc的擴增對腫瘤的預後判斷有意義，L - myc擴增與腫瘤的易患性和預後在不同的腫瘤中表現不一樣。研究表明，myc基因產物，尤其是c - myc在誘導細胞凋亡過程中也起重要作用。
結構及表達
c-myc基因是禽類髓細胞病毒(AMN)MC-29的V-myc的細胞同源序列，從MC-29病毒 中分離的V-myc是gag-myc融合體，它由1358個bp的gag基因與1568個bp的V-myc基因共 同組成.C-myc基因由3個外顯子及2個內含子組成，第一個外顯子不編碼，只起調節作 用，只有外顯子2和3與V-myc相對應，編碼一個439個胺基酸的蛋白質.C-myc基因由啟 動子P1或P2起始轉錄並在第一內含子中尚有一個潛在啟動子P，當第一個內含子發生 斷裂時，P可被激活而成為一個異常轉錄起始點，但蛋白合成起始位點不變，並與正 常C-myc基因產物相同.在各種不同動物中，C-myc基因和第2.3外顯子具有高度保守 性，而第1外顯子則有較大的差異.小鼠和人的外顯子1隻有70%的同源性.人類C-myc基 因定位於8q24.在生理學上，C-myc基因的表達一般與細胞的生長狀態有關，如有生長 因子刺激成纖維細胞，可導致C-myc表達增強，相反，在細胞分化時C-myc表達降低， 在細胞培養過程中，用C-myc表達結構或反義寡脫氧核酸進行研究，發現C-myc在細胞 G0期到S期的過程中也起作用.表明C-myc表達的變化與細胞的增殖及分化狀態有關， 其表達產物在調節細胞生長、分化或惡性轉化中發揮作用。
產物及功能
C-myc基因的產物為62KD的磷酸化蛋白P62c-mgc，是由C-myc基因的外顯子2和3共 同編碼的由439個胺基酸組成的蛋白質，定位細胞核內，為核蛋白，依C-one編碼產 物，功能分類，C-myc癌基因屬核蛋白基因，具有轉化細胞的能力，並具有與染色體 DNA結合的特性，在調節細胞生長、分化及惡性轉化中發揮作用.C-Myc蛋白在結構上 可分為轉錄激活區，非特異DNA結合區，核靶序列，鹼性區，螺旋一環一螺旋(HLH)及 亮氨酸拉鏈區，在已知的轉錄因子中可介導蛋白的寡聚化，這兩個區同時存在是 C-myc蛋白所特有的，在其它蛋白質中，很少發現.在C-Myc蛋白中，螺旋一環一螺旋 緊隨著鹼性區，揭示其以特異性序列方式和DNA相互作用.在以原核生物為實驗對象的 研究表明，該鹼性區以一個自由環存在，當以特殊方式結合到DNA上時，則變成螺 旋，該區是C-Myc蛋白與DNA特異序列的結合部位.
在C-Myc中還存在著與抑制細胞分化、自身抑制有關的區域及腫瘤轉化所必需的 區域.Smith等研究了C-Myc的亮氨酸拉鏈區，該區介導各種轉錄因子的二聚作用.在亮 氨酸重複部位的突變能顯蓍降低C-myc抑制鼠紅白血病(MEL)細胞分化能力，同樣地， 此區的插入突變能消除C-Myc的轉化活性.正是這些C-myc結構成分的表達阻止了細胞 進入細胞周期，從而抑制許多細胞系的分化.Cronch等對C-Myc亮氨酸拉鏈區的亮氨酸 進行致突變，發現這些突變不能自身抑制，說明了亮氨酸拉鏈區在自身抑制中的重要 性.Stone等研究認為，C-Myc分子的中間1/3以及N-端，C-端是腫瘤轉化所必需的，是 C-myc基因與腫瘤轉化有關的C-myc區段.正是由於這些C-Myc功能區域的存在，從而使 C-Myc在胞漿內合成後，與其它蛋白形成寡聚體，再轉移到核內，並結合到特異性的 DNA序列上，從而激活和抑制許多靶基因的轉錄，引起細胞生長和分化的改變，發揮 其生理調節功能及惡性轉化作用.
對程式性細胞死亡Programmed Cell death. PCD)研究的深入，發現Myc蛋白參與誘導細胞凋亡.C-myc基因表達的失調是多種細胞凋亡的主要誘因，細胞發生凋亡的速度及其對誘導因素的敏感性均依賴於細胞Myc蛋白的含量.尚未成熟胸腺細胞中 Myc基因的高表達是胚胎胸腺細胞凋亡壞死的誘因.而且在細胞凋亡階段，也觀察到C-myc基因的高水平表達，如果用反義寡核苷酸阻斷C-myc基因的表達，則細胞凋亡受到嚴重干擾.Evan研究發現，C-myc表達的失調也會啟動去除生長因子後培養細胞的成熟前凋亡.他們對小鼠IL-3依賴性髓樣細胞素32D進行觀察，發現在洗去IL-3後， 可立即觀察到C-myc基因表達下調.結果使培養細胞停止於G1期，將攜帶C-myc基因的 載體轉染32D細胞，獲得穩定表達C-myc基因的32D細胞克隆，結果這種細胞去除H-3 後，不停止於G1期，而是啟動以凋亡為特徵的程式性細胞死亡.結果揭示細胞凋亡是清除定點突變及細胞周期調控失衡的細胞的重要機制，一旦細胞發生障礙，C-myc基 因會啟動凋零程式，相反，則導致腫瘤形成。
人類腫瘤
C-myc基因主要通過擴增和染色體易位重排的方式激活，與某些組織腫瘤的發 生、發展和演變轉歸有重要關係.在不同的人體腫瘤細胞系中，包括粒細胞性白血病 細胞系，視網膜母細胞瘤細胞系，某些神經母細胞病細胞系，乳腺癌細胞系及某些肺 癌細胞系，已發現C-myc或C-myc相關序列的擴增，在人結腸癌細胞系中也觀察到 C-myc基因的擴增.C-myc癌基因已在成骨肉瘤、軟骨肉瘤、脊索瘤、脂肪肉瘤、橫紋 肌肉瘤中發現擴增，當擴增達到30倍時，染色體上表現HSR和DMS，而且C-myc過量表 達與腫瘤的早期復發有關，在致瘤中，已發現ras與myc、sis與myc、myc與fos偶聯激 活，協同致瘤等.
許多資料表明C-myc位點在所有受檢的B細胞腫瘤中有重排，Casares等發現定位 在8號染色體上的C-myc與定位在14號染色體上的Ig重鏈基因有同樣的14.2Kb的ecori 酶切片段，因而發生8∶14易位可能是何杰氏淋巴瘤的一個普通標誌.N-myc在人神經 位母細胞瘤.視網膜母細胞瘤和小細胞肺癌中有擴增，擴增的程度與腫瘤的發病進程 有關.Schwab等報告20%的神經母細胞瘤有N-myc擴增，其中大多數是侵襲性腫瘤.Seege r等報告基因拷貝數的多少預示疾病的進程，總的來說，帶有一個拷貝數的Ⅰ、Ⅱ、 Ⅲ、Ⅳ.期神經母細胞瘤常規治療效果較好，帶有多個拷貝的Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期病人，病 情將不斷加重.c-myc首先被發現與小細胞肺癌有關，30%的病例c-myc擴增，復發病人 中，myc擴增者的生存期短於沒有擴增的病例，研究還發現接受化療的腫瘤病人易引 起myc擴增.有關myc基因擴增與其它腫瘤的關係也有許多報導，認為胃癌、乳腺 癌、結腸癌、宮頸癌、何杰金氏病及頭部腫瘤等都有myc基因的擴增或過度表達
臨床意義
過度表達，見於各種腫瘤，如肺癌，胃癌，乳腺癌，結腸癌，宮頸癌，某些神經母細胞病，粒細胞性白血病 ，視網膜母細胞瘤，成骨肉瘤，軟骨肉瘤，脊索瘤，脂肪肉瘤，橫紋肌肉瘤，何杰金氏病及頭部腫瘤等都有myc基因的擴增或過度表達。建立同時檢測Myc基因3個成員L-myc 、N-myc及C-myc異常擴增的簡便方法。方法 採用聚合酶鏈反應(PCR)技術，用一對引物同時擴增Myc基因3個成員第2外顯子中的高度保守區，擴增產物經非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳及雷射掃描。結果 此法可以檢測Myc基因家族中3個成員的擴增情況。 經檢測，正常組織細胞沒有Myc基因擴增，32例喉癌組織中47%有L-myc和C-myc擴增，41%有N-myc 擴增，與正常比差異均有顯著意義(χ=6.764,7.609, 5.961;P均<0.05)。C-myc擴增率與用PCR-瓊脂糖凝膠電泳檢測的結果基本相符(χ=0.254,P>0.05) 。結論 此法對檢測腫瘤組織中Myc基因3個成員提供了簡易、特異、 無放射污染，並且適於臨床套用的、優於PCR-瓊脂糖凝膠電泳的方法。
論文
至今Myc基因已被發現了至少3種，C-myc、N-myc和L-myc
討論
國內外用於檢測N-myc、L-myc及C-myc的方法大多採用各種雜交技術。由於套用放射性同位素，需要各種防護措施，不安全又複雜，且一次只能檢測Myc基因家族中的一個基因，臨床上很難常規套用。PCR－瓊脂糖凝膠電泳技術簡單、易行、快速，但由於靈敏度低，不能分開只相差3個bpDNA的L-myc和N-myc，所以只能檢測C-myc的相對擴增，而不能檢測N-myc或L-myc擴增或二者的同時擴增。而且，如果有N-myc或L-myc擴增或二者同時擴增時，即使有C-myc擴增，也會出現假陰性結果。我們首先把PCR技術與中性聚丙烯醯胺凝膠電泳及雷射掃描技術結合起來，並用硝酸銀試劑使凝膠上的Myc 基因雙鏈染成黑褐色。這樣的實驗結果特異性高，方法簡單，成本低，又避免了放射性同位素的一切弊端，很適合於臨床套用。聚丙烯醯胺凝膠電泳解析度高於瓊脂糖凝膠電泳，具備分離只相差一個核苷酸的不同DNA片段的特性。在中性聚丙烯醯胺凝膠中，雙鏈DNA片段的電泳遷移率主要由DNA片段長短決定，而與其鹼基組成和順序基本無關。基於以上原理，我們設計了此實驗，目的是能把瓊脂糖凝膠電泳上沒有分開的只相差3 bp的N-myc和L-myc分開，作到一次可同時檢測3種Myc基因的擴增情況。實驗表明：用PCR-中性聚丙烯醯胺凝膠電泳和用PCR-瓊脂糖凝膠電泳檢測C-myc基因結果基本相符， 說明本研究建立的方法結果可靠。Myc基因是較早發現的一組癌基因，Myc基因的異常擴增或表達，參與了很多腫瘤的發生和發展。本研究方法對進行3種Myc基因在腫瘤形成過程中作用機理的研究，提供了簡便易行的實驗手段。
結果
1.PCR-瓊脂糖凝膠電泳結果：實驗設計的引物擴增Myc 3種基因，經PCR擴增，喉癌組織及正常組織細胞DNA在瓊脂糖凝膠上均可見2條小於300 bp 的電泳帶。第1條帶為N-myc( 230bp)和L-myc(227 bp)2個DNA片段合成帶，因兩者只相差3 bp，故瓊脂糖凝膠電泳不能將其分開而呈現1條帶；第2條電泳帶為C-myc基因(244 bp)。 將電泳結果拍照後的底片在雷射掃瞄器進行掃描，得出2條帶的峰面積值。正常組織細胞的C-myc帶比N-myc和L-myc合成帶密度弱，比值小於1，求出正常組織細胞的C×(N+L)均值為0.6 。
C-myc擴增倍數=喉癌的C×(N+L)×0.6，考慮實驗中的綜合因素，定為1.5倍以上有C-myc擴增。結果顯示：喉癌中有42%的C-myc擴增，正常組織細胞沒有C-myc的擴增。
2.PCR-中性聚丙烯醯胺凝膠電泳結果：由於中性聚丙烯醯胺凝膠電泳對DNA的分離特性，經PCR擴增後的Myc基因電泳帶顯示3條。第1條帶為L-myc(227 bp)，第2條為N-myc(230 bp)，第3條為C-myc(244 bp) 。將擴增出特異性Myc基因電泳帶的凝膠片，直接在雷射掃瞄器上進行掃描，得出3條帶的峰面積值。然後用各自的峰面積值除以各自的鹼基數，作為該基因的單拷貝數，將L-myc、N-myc和C-myc三者中最小的單拷貝數設定為1，比較其他2個基因的相對倍數。正常組織細胞L-myc∶N-myc∶C-myc均值為1.0∶2.2∶3.8。結果32例喉癌中47%有L-myc和C-myc的擴增，41%有N-myc擴增。C-myc的擴增率與用PCR-瓊脂糖凝膠電泳檢測的結果基本一致(χ=0.254，P>0.614)。
材料
1.標本：32例喉癌組織取自我院耳鼻咽喉科住院病人，7例正常喉組織取自我科同期住院的非癌症病人，3例正常白細胞取自我院血庫人全血。所有標本均經病理證實。根據喉癌組織病理分化程度不同，分為高、中、低分化癌。
2.PCR引物：5′-CCCAGCGAGACATCTGGAAGAA-3′，5′-GAGAAGCCGCTCCACATGCAGTC-3′。擴增Myc基因家族的3個基因，即C-myc(244 bp)，N-myc(230 bp)，L-myc(227 bp)，由上海復旦大學遺傳學研究所合成。
方法
1.模板DNA提取：參照參考文獻[3]方法進行。
2.PCR擴增：PCR擴增總反應體積50 μl，套用模板DNA 50 ng，在DNA擴增儀操作(Perkin Elmer Cetus)，循環周期為94℃1分鐘，55℃1分鐘，72℃2分鐘，經過30個循環後，補加72℃7分鐘。
4.非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳步驟：取PCR產物5 μg加1 μl上樣緩衝液之後備用。製備8%非變性聚丙烯醯胺凝膠，灌注於20 cm×20 cm×0. 1 cm垂直板電泳槽中， 待凝膠聚合後加樣，用1×TBE緩衝液作電極緩衝液，室溫下電泳1瓦特約14小時，待指示劑溴酚藍移到邊緣時停止電泳。將電泳後的凝膠移至方盤中進行硝酸銀染色。染色過程如下：用雙蒸餾水(dH2O)洗凝膠3次後浸泡於染色液(硝酸銀1g，加dH2O至500 ml)中30分鐘，去掉染色液，用dH2O漂洗3次凝膠，然後浸泡於顯色液(NaOH15g，38%甲醛3.8 ml，加dH2O至500ml)中約10分鐘，當顯出棕黑色DNA區帶時，用dH2O洗1次凝膠後，浸於停影液(冰醋酸25 ml，加水至500 ml)中約30分鐘，然後把凝膠移至固定液(乙醇25 ml，冰醋酸2.5 ml加dH2O至500 ml)中固定。固定後的凝膠在看片燈上觀察結果、拍照片，凝膠直接在雷射掃瞄器進行掃描。
，3者在第2外顯子中有2個區域高度同源，3個基因分別表達各自獨立的蛋白，它們的生理作用基本一致。研究表明，在許多腫瘤細胞中有Myc基因擴增或異常表達，但在不同的腫瘤組織和癌細胞系中，Myc基因家族的成員在擴增或表達方面有些差異。因此，深入研究Myc基因3個成員與人類腫瘤的關係非常有意義。本研究建立的PCR-非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳-雷射掃描技術，可同時檢測腫瘤組織中3種Myc基因的擴增情況，在腫瘤發生髮展過程中，為進行3種基因各自作用機理的研究提供了簡易的實驗手段。
