真菌定義,ITS定義,RNA（rRNA）結構,ITS原理,套用舉例,ITS方法學,局限性,
真菌定義
一類單細胞或多細胞微生物。不含葉綠素，大都能形成硬的多糖細胞壁。屬於真核生物，最常見的真菌是各類蕈類，另外真菌也包括黴菌和酵母。現在已經發現了七萬多種真菌，估計只是所有存在的一小半。大多真菌原先被分入動物或植物，現在成為自己的界，分為四門。
ITS定義
ITS（Internal Transcribed Spacer）：內轉錄間隔區，是位於真菌核糖體RNA（rRNA）基因轉錄區或對應多順反子rRNA前體中大、小亞基rRNA之間的核酸序列。用於真菌鑑定的ITS序列通常包括ITS1、5 .8 S 和ITS2。真菌ITS 區域長度一般在500 ～750 bp( 鹼基對)。
RNA（rRNA）結構
組成真核生物核糖體RNA( rRNA) 有5 、5 .8 、17 ～18( 以下統稱為18 S) 和25 ～28 S( 以下統稱為28 S) 。對於大多數真核生物來說, 核糖體rRNA 基因群的一個重複單位( rDNA) 包括以下區段( 按5′→3′方向) : ①非轉錄區( Non Transcribed Sequence), 簡稱NTS ; ②外轉錄間隔區( External Transcribed Spacer), 簡稱ETS ; ③18 S rRNA 基因, 簡稱18 SrDNA ; ④內轉錄間隔區1( Internal Transcribed Spacer 1) , 簡稱ITS1 ; ⑤5 .8 S rRNA基因, 簡稱5 .8 SrDNA; ⑥內轉錄間隔區2 , 簡稱ITS2 ; ⑦28 SrRNA 基因, 簡稱28 S rDNA。ITS1 和ITS2 常被合稱為ITS, 並且5 .8 S RNA 基因也被包括在ITS 之內。核糖體內轉錄間隔區包含2 個不同的非編碼區域, 即ITS1 和ITS2 。ITS 序列在物種屬內、近緣屬間乃至科內系統進化關係研究中有一定的價值。真菌核糖體基因由小的亞單元( 18 S) 、ITS1 區、5 .8 S 區、ITS2 區和大的亞單元( 28 S) 構成, 頭尾串聯形成重複序列, 一個基因組內有60 ～200個拷貝。
ITS原理
rDNA 上的5 .8 、18 和28 SrRNA 基因有極大的保守性, 即存在著廣泛的異種同源性。而由於ITS 區不加入成熟核糖體, 所以ITS 片段在進化過程中承受的自然選擇壓力非常小,因此能容忍更多的變異。在絕大多數的真核生物中表現出了極為廣泛的序列多態性, 即使是親緣關係非常接近的2 個種都能在ITS 序列上表現出差異, 顯示最近的進化特徵。研究表明,ITS 片段的進化速率是18 S rDNA 的10 倍。這就是ITS 序列在微生物種類鑑定和群落分析的理論基礎。ITS1 和ITS2 是中度保守區域, 其保守性基本上表現為種內相對一致, 種間差異比較明顯。這種特點使ITS 適合於真菌物種的分子鑑定以及屬內物種間或種內差異較明顯的菌群間的系統發育關係分析。由於ITS 的序列分析能實質性地反映出屬間、種間以及菌株間的鹼基對差異, 此外ITS 序列片段較小、易於分析, 目前已被廣泛套用於真菌屬內不同種間或近似屬間的系統發育研究中。ITS 的序列分析還有效地解決Lenti nul a 、Suill us 、Tuber 、Cer at ocystis 和Oi diodendron等真菌套用形態學特徵進行分類所引起的紛爭, 彌補了傳統分類上的一些不足。
套用舉例
Yan 等利用ITS 序列分析和比較形態學研究了被一些人認為是同種異名的Phi alophoraamericana 和P . verrucose , 得出了它們是不同種的結論。
章桂明根據對小麥印度腥黑粉菌( Tilletia indica) 及其近似種的ITS 序列分析和形態學比較結果, 提出黑麥草腥黑粉菌( T. wal keri ) 與T . i ndi ca 應是同一個種, 建議將黑麥草腥黑粉菌列為我國對外檢疫性有害生物。
張正光等對非洲菊根腐病病原疫黴菌的形態特徵、致病性及核糖體DNA-ITS 序列進行分析,表明分離菌株與GenBank 中隱地疫霉的ITS 序列的同源性均為99 .87% , 僅有1 個鹼基的差異, 進一步明確從非洲菊腐爛病植株根部分離的病原菌為隱地疫霉( Phyt opht hora cryptogea)。
楊雅雲等比較了馬鈴薯、番茄晚疫病菌的核糖體DNA ITS 區段序列的差異, 發現不可交叉的2 類菌株間的同源性為98 .28 % , 可交叉侵染的番茄菌株和馬鈴薯菌株之間的同源性為99 .17% , 說明相似的序列使得生物學特性也很相似, 反之, 同源性有差異的, 在生物特性上也表現出一定差異。
楊臘英等通過比對所測序的香蕉炭疽菌與GenBank 中炭疽菌屬中其他幾個種的ITS 全序列, 找出可用於檢測香蕉炭疽菌的特異性引物, 為香蕉炭疽菌株的快速、準確檢測提供了必要的依據。
ITS方法學
真菌rDNA ITS 序列分析用於真菌系統分類通常通過多聚酶鏈式反應( PCR) 技術實現。rDNA 多複製的特性, 有利於低濃度或被更高度降解的DNA 樣品中ITS區域的擴增。這有利於研究尚無任何rDNA 序列資料的生物。根據這些基因上高度保守區段設計出通用引物, 藉助PCR 技術擴增rDNA 的目的片段。PCR 技術在真菌分類、鑑定中與直接測序法相結合有很大的優越性[ 14] : ①只需少量的DNA, 每次擴增只需約0 . 1 ～10 ng ; ②可對DNA 的2 條鏈測序, 從而減少錯誤; ③可利用總DNA 的較粗製備品; ④適合於自動測序儀進行測序。
局限性
以ITS 序列作為分子標記的套用技術的最大限制是有的真菌由於進化順序、變異, 甚至分析方法等原因, 在間隔區上表現的差異性較小, 不適合於屬內種及種群的標記。
