《HPLC-ICP-MS研究砷甲基化酶的催化機制及其影響因素》是依託南京大學，由王志林擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：HPLC-ICP-MS研究砷甲基化酶的催化機制及其影響因素
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：王志林
- 依託單位：南京大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
本研究課題將著重圍繞砷甲基化酶的催化機制及其影響因素展開如下幾點工作：（1）運用分子模擬方法建立砷甲基化酶結構模型，研究底物、還原劑和甲基供體與hAS3MT之間的相互作用，尋找關鍵的胺基酸位點，並通過定點突變的方法研究這些位點的作用，探討hAS3MT結構與功能之間的關係。（2）建立合適的分離分析條件，運用HPLC-ICP-MS技術研究重組hAS3MT催化砷甲基化過程中可能存在的中間產物（如含硫砷甲基化物，DMA，MMA等），探討不同還原劑在hAS3MT催化砷甲基化過程中的作用，詳細闡述砷的甲基化過程。（3）以人肝臟細胞研究砷代謝過程中的中間產物和終產物，從而繪製砷代謝的典型路線圖，對砷在體內的分布、遷移和代謝給出科學的闡述。（4）利用有效的動物模型，研究砷的代謝過程以及過渡金屬和硒對砷代謝的影響，為治療砷中毒提供科學依據。
結題摘要
本項目圍繞HPLC-ICP-MS研究砷甲基化酶的催化機制及其影響因素進行了系統研究，取得了以下有新意的研究成果：(1) 以SAM-CmArsM和As-CmArsM結構為模板，運用modeller9v8分別建立了WT-hAS3MT-SAM和WT-hAS3MT-As的模型。用Accelrys Discovery Studio 將兩個模型進行疊加得到了WT-hAS3MT-SAM-As的模型。(2) 建立了複雜生物樣品中不同形態砷的HPLC-ICP-MS的檢測方法；運用HPLC-ICP-MS、CD和FTIR等方法研究了8個半胱氨酸突變體結構和功能的關係，系統闡述了hAS3MT中半胱氨酸的作用，確定了Cys61是除Cys156和Cys206以外的第三個砷的結合位點；質譜結果表明：Cys32和Cys250以及Cys368和Cys369分別形成了分子內的二硫鍵。(3) 運用HPLC-ICP-MS、CD和FTIR等方法系統地研究了hAS3MT中甲基供體SAM可能的結合區域。用modeller9v8建立了各個突變體與SAM的模型，根據實驗和理論模型綜合分析得出：57-RYYG-60、78-GSGSG-82和155-NCV-157與SAM中的甲硫氨酸相互作用；而101-IDMT-103和135-YIE-137則與SAM中的核糖腺苷有相互作用；C156和L160是距SAM和As 5 Å範圍內共有的胺基酸，它們與甲基轉移過程密切相關；G78、G80和G82屬於GXGXG區域，位於連線hAS3MT中第一個β-摺疊和α-螺旋的環內；Y58、Y59、N155、C156 和L160在S+-CH3向As的孤對電子靠近的情況下固定S+-CH3，並進一步促進甲基轉移過程；G78、D102、M103、T104、I136和N155與SAM形成氫鍵。(4)系統探討了不同還原劑、SAH、硒及若干過渡金屬元素對hAS3MT的活性的影響。非巰基還原劑TCEP和內源性還原劑DHLA同樣可以作為砷甲基化體外代謝反應的功能性還原劑，表明GSH並不是唯一的砷甲基化代謝反應功能還原劑。(5) 運用快平衡動力學模型結合CD和螢光光譜等方法探究了三個反應物（SAM，還原劑和砷）在hAS3MT催化下的反應順序，並進一步探究了hAS3MT催化的砷甲基化反應分子機制。該工作對進一步探究體內砷甲基化代謝及其功能具有重要的參考意義。
