《HPLC-ICP-MS和砷螢光探針研究細胞內無機砷代謝及其影響因素》是依託南京大學，由王志林擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：HPLC-ICP-MS和砷螢光探針研究細胞內無機砷代謝及其影響因素
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：王志林
- 依託單位：南京大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
本研究課題將著重圍繞HPLC-ICP-MS和砷螢光探針研究細胞內無機砷代謝及其影響因素開展如下幾點工作：（a）設計和合成一系列亞砷酸、砷酸、MMA和DMA的螢光探針，結合螢光光譜和螢光成像技術篩選出選擇性好、靈敏度高、激發波長長、生物相容性優良且能套用於活體細胞檢測的新型砷螢光探針。（b）以人正常或原代肝細胞和HepG2細胞為模型，運用HPLC-ICP-MS研究砷代謝過程中的中間產物和終產物，從而繪製砷代謝的典型路線圖。（c）構建人砷甲基化酶的真核表達載體pEGFP-N1-AS3MT，轉染人泌尿道上皮細胞和人白血病細胞，建立穩定表達的細胞系，運用HPLC-ICP-MS研究無機砷在穩定表達細胞系中的代謝，並探討不同還原劑、過渡金屬元素及硒對細胞內砷代謝的影響。（d）運用螢光探針的實時可視化功能對無機砷的攝取和代謝進行跟蹤，從而對砷在細胞內的分布、遷移和代謝給出科學的闡述。
結題摘要
本研究課題將著重圍繞HPLC-ICP-MS和砷螢光探針研究細胞內無機砷代謝及其影響因素開展如下幾點工作：（1）運用HPLC-ICP-MS研究了無機砷在HepG2細胞和白血病細胞NB4中代謝的中間產物和終產物，推測了砷在細胞中代謝路線圖。（2）運用HPLC-ICP-MS研究了硒對無機砷在NB4細胞內代謝的影響，在細胞水平上進一步驗證了砷硒拮抗的現象並初步提出了砷硒拮抗的機制。（3）運用HPLC-ICP-MS研究了DMSA對NB4細胞中砷甲基化的影響，初步探討了DMSA的解毒機制。（4）套用RT-PCR以及western-blot等多種分子生物學方法探究了As3+，As4S4以及亞硒酸（Se4+）對APL細胞凋亡和分化的影響及相應的分子機制。實驗結果表明，當As4S4在低濃度範圍（0.1-0.4 μM）時，通過降解白血病蛋白-維甲酸受體α（PML-RARα）融合蛋白來誘導APL細胞分化；當As4S4在高濃度範圍（0.5-2.0 μM）時，誘導相應的細胞通過與ROS相關的多種通路凋亡。2.0-4.0 μM的Se4+同時誘導APL細胞的凋亡和分化；Se4+（2.0-4.0 μM）主要通過抑制核因子-кB（NFкB）信號通路來誘導APL細胞凋亡，並通過降解PML-RARα融合蛋白來誘導細胞分化。As3+和Se4+（2.0-4.0 μM）聯用不但可以促進APL細胞的凋亡和分化，還能降低細胞內由As3+引起的ROS累積。這說明，二者協同可以更好地治療APL。（5）設計合成了PPi的螢光探針並將其套用在酶催化活性分析中。（6）設計合成了分別具有溶酶體和細胞膜靶向的陽離子型水溶性聚噻吩衍生物PEMTEI和PMTPP， 它們對ATP具有高選擇性和靈敏度，且毒性低、生物相容性好、在細胞中光學穩定性高，可作為螢光探針分別套用於溶酶體和細胞膜ATP濃度變化的實時監測。運用PEMTEI和螢光成像技術，本論文首次發現，在藥物刺激下，HeLa細胞中的溶酶體能夠通過鈣離子調節的胞吐作用釋放ATP；進一步研究表明，在細胞凋亡過程中，細胞膜中的ATP水平上升。此外，PMTPP也可成功套用於小鼠腫瘤組織中ATP濃度變化的實時監測。
