雙脫氧鏈終止法

雙脫氧鏈終止法主要用於DNA基因分析，是現在套用最多的核酸測序技術（也即第一代DNA測序技術），由Sanger等1977年發明提出。

基本介紹

• 中文名：雙脫氧鏈終止法
• 外文名：The dideoxy chain-termination method
• 發現年代：1977年
• 發現者：Frederick Sanger
• 套用範圍：DNA基因分析
• 歸屬範圍：核酸測序技術
• 原理：四種單脫氧鹼基複製或轉錄
• 又稱：“桑格法”（Sanger Method）

原理

核酸模板在核酸聚合酶、引物、四種單脫氧核苷酸存在條件下複製或轉錄時，如果在四管反應系統中分別按比例引入四種雙脫氧核苷酸，只要雙脫氧核苷酸摻入鏈端，該鏈就停止延長，鏈端摻入單脫氧核苷酸的片段可繼續延長。如此每管反應體系中便合成以共同引物為5’端，以雙脫氧核苷酸為3’端的一系列長度不等的核酸片段。反應終止後，分四個泳道進行電泳。以分離長短不一的核酸片段（長度相鄰者僅差一個核苷酸），根據片段3’端的雙脫氧核苷酸，便可依次閱讀合成片段的核苷酸排列順序。

測序程式

（一） Sanger雙脫氧鏈終止法（酶法）測序程式 操作程式是按DNA複製和RNA反轉錄的原理設計的。

1.分離待測核酸模板，模板可以是DNA，也可以是RNA，可以是雙鏈，也可以是單鏈。

2.在4隻試管中加入適當的引物、模板、4種dNTP（包括放射性標記的ddNTP，例如³²P ddNTP和DNA聚合酶（如以RNA為模板，則用反轉錄酶），再在上述4隻管中分別加入一種一定濃度的ddNTP（雙脫氧核苷酸）。

3.與單鏈模板（如以雙鏈作模板，要作變性處理）結合的引物，在DNA聚合酶作用下從5’端向3’端進行延伸反應，32P隨著引物延長摻入到新合成鏈中。當ddNTP摻入時，由於它在3’位置沒有羥基，故不與下一個dNTP結合，從而使鏈延伸終止。ddNTP在不同位置摻入，因而產生一系列不同長度的新的DNA鏈。

4.用變性聚丙烯醯胺凝膠電泳同時分離4隻反應管中的反應產物，由於每一反應管中只加一種ddNTP（如ddATP），則該管中各種長度的DNA都終止於該種鹼基（如A）處。所以凝膠電泳中該泳道不同帶的DNA 3’ 末端都為同一種雙脫氧鹼基。

5.放射自顯影。根據四泳道的編號和每個泳道中DNA帶的位置直接從自顯影圖譜上讀出與模板鏈互補的新鏈序列。

操作步驟

（以雙鏈DNA測序為例）。

變性雙鏈模板的製備

（1） 材料 Tris/葡萄糖緩衝液（20mmol/L Tris-HCl pH8.0，10mmol/L EDTA，50mmol/L 葡萄糖），1% SDS，0.2mo1/L NaOH，異丙醇，TE緩衝液pH8.0，4mol/L LiCl，冰冷 70%和無水乙醇，2mol/L NaOH，2mmol/L EDTA。

（2） 配製方法

① 取1.5ml處於對數生產期的培養菌液（含有待測病毒核酸的重組質粒模板），離心除去上清液後，用150ml Tris/葡萄糖緩衝液 重懸菌團，在室溫下放置5分鐘。

② 加入300ml的1%SDS，0.2mol/L NaOH，顛倒混契約15次，在室溫下放置15分鐘，加入225ml 3mol/L醋酸鈉（pH4.5），顛倒約15次混合，在冰浴中放置45分鐘，然後離心5分鐘。

③ 將650ml上清液轉移至一支新管中，加入650ml異丙醇，混合後在室溫下放置10分鐘，離心5分鐘後棄去異丙醇，抽真空乾燥沉澱。

④ 用125ml TE(pH 8.0）重新溶解DNA，加入375ml的4mol/L LiCl，在冰浴中放置20分鐘後，於4℃下離心5分鐘。

⑤ 將上清液轉移至一支新管中用飽和苯酚抽提後再用氯仿抽提，加入2倍體積的異丙醇，在室溫下沉澱30分鐘，離心5分鐘，棄去上清液。

⑥ 用冰冷的70%乙醇洗沉澱，離心5分鐘，棄去上清液並乾燥，用50ml TE緩衝液重新溶解沉澱。用紫外分光光度計測定質粒DNA含量。

⑦ 取0.2mg質粒DNA，並將體積調至9ml，加入1ml 2mol/L NaOH，2mmol/L EDTA，在室溫下放置5分鐘，加入2ml 30mol/L醋酸鈉（pH 4.5）和8ml水。

⑧ 加入6ml冰冷無水乙醇，混合後在乾冰/乙醇浴中放置15分鐘，在4℃下離心5分鐘，小心地棄去上清液，用冰冷的70%乙醇洗沉澱，離心5分鐘並小心地棄去上清液，真空抽乾沉澱，並用TE緩衝液重新溶解沉澱。

延伸和終止反應

以利用T7DNA聚合酶進行的雙脫氧鏈終止反應為例。

（1） 材料 變性的雙鏈DNA模板（溶解在TE緩衝液中），0.5pmol/mL寡核苷酸引物（溶解在TE中，-20℃貯存），5×測序緩衝液（200mmol/L Tris pH7.5，50mmol/L MgCl2，-20℃貯存），0.1mol/l DTT（當月新配-20℃貯存），15pmol/L的3種dNTP混合物（缺dATP），1 000至1 500Ci/mmol32p dATP（在－20℃下達4至6周），修飾的T7 DNA聚合酶，標準酶稀釋溶液（20mmol/L Tris－HCl pH7.5，0.5mg/mlBSA，10mmol/L- 巰基乙醇，4℃貯存），終止混合物（表2-30），甲醯胺上樣緩衝液（0.2ml 0.5mol/LEDTA pH8.0，10mg溴酚藍，10mg二甲苯青，10ml甲醯胺）。

表2-30 T7DNA聚合酶終止反應混合物

反應成分 ddG ddA ddT ddC 最終濃度

H2O 15 15 15 15 －

5×測序緩衝液 6 6 6 6 － 1mmol/L

4dNTP 6 6 6 6 200μmol/L

1mmol/L ddGTP 3 － － － 20μmol/L

1mmol/L ddATP － 3 － － 20μmol/L

1mmol/L ddTTP － － 3 － 20μmol/L

1mmol/L ddCTP － － － 3 20μmol/L

（2） 配製方法

① 取4支0.5ml小離心管，標上G、A、T、C，每管加入7ml變性的雙鏈DNA模板（分別為1和2mg），1ml寡核苷酸引物和2ml 5×測序緩衝液混合，65℃保溫2分鐘，在室溫下冷卻30分鐘。

② 每管加入1ml 0.1mol/L DTT，2ml 1.5mol/L 3種dNTP混合物，0.5ml32P dATP和2ml（2IU）修飾的T7DNA多聚酶混合物，在室溫下放置5分鐘。

③ 按標記每管分別加入3ml 4種ddNTP終止混合物的一種。

④ 短促離心後，在37℃下保溫5分鐘。

⑤ 加入5ml甲醯胺上樣緩衝液，上樣前在80℃下加熱2分鐘，並迅速置於冰浴上，每個樣品取3ml，上樣電泳。

測序反應物電泳和序列讀取

（1） 按普通聚丙烯醯胺凝膠製作方法製作梯度膠。

（2） 按G、A、T、C次序加入每種樣品，在G、A和T各泳道上樣1ml，而在C泳道上樣1.5ml。

（3） 上樣完畢加壓1700V電泳，根據樣品中溴酚藍和二甲苯青染料遷移情況確定電泳時間。

（4） 電泳完畢，在10℃冰醋酸中漂洗30分鐘脫去尿素。

（5） 在60℃或80℃乾燥30分鐘後，放射自顯影讀取序列。

讀取合成鏈的核苷酸序列時，應從下往上讀取。因為電泳時是從上向下的，即上為負極，下為正極，DNA帶負電，從負極向正極移動。其中，小片段DNA移動速度最快，距離正極的點樣處最遠。所以，應該從最小片段讀起，即，從下向上讀取。

而模板鏈則應該從上向下讀取，並且轉換為測序的核苷酸的互補的核苷酸。