酶切是對粘末端的DNA分子和載體分子進行切割，以獲得相應的粘末端連線。酶切可以是單酶切也可以是雙酶切。單酶切操作比較簡單，雙酶切困難。
定義,步驟,
定義
酶切可以是單酶切也可以是雙酶切。單酶切操作比較簡單，但雙酶切如果兩種酶所用緩衝液成分不同（主要是鹽離子濃度不同）或反應溫度不同，這時可以採用如下措施解決：1）先用一種酶切，然後乙醇沉澱回收DNA分子後再用另外一種酶切；2）先進行低鹽要求的酶酶切，然後添加鹽離子濃度到高鹽的酶反應要求，加入第二種酶進行酶切；3）使用通用緩衝液進行雙酶切。具體要根據酶的反應要求進行，儘量避免活力損失。
步驟
一、實驗材料準備
2. 試劑：限制性內切酶、ddH2O。
3 . 儀器：微量移液槍，離心機，水浴鍋， 電泳儀，紫外透射觀測儀。
二、單酶切
1. 在1.5 mL滅菌離心管中依次加入：
（1）質粒DNA：X μL（約1 μg）。
（2）限制性內切酶：1 μL（約10 U）。
（3）10×buffer：2 μL。
（4）ddH2O：補足20 μL。
1. 在1.5 mL滅菌離心管中依次加入：
（1）質粒DNA：X μL（約1 μg）。
（2）限制性內切酶：1 μL（約10 U）。
（3）10×buffer：2 μL。
（4）ddH2O：補足20 μL。
2. 混勻，做好標記。
3. 37℃水浴1-3 h。
4. 70℃水浴10 min中止反應。
5. 電泳檢測酶切效果。
三、雙酶切
1. 在1.5 mL滅菌離心管中依次加入：
（1）質粒DNA：X μL（約1 μg）。
（2）限制性內切酶1：1 μL（約10 U）。
（3）限制性內切酶2：1 μL（約10 U）
（3）10×buffer：1或2 μL。
（4）ddH2O：補足20 μL。
1. 在1.5 mL滅菌離心管中依次加入：
（1）質粒DNA：X μL（約1 μg）。
（2）限制性內切酶1：1 μL（約10 U）。
（3）限制性內切酶2：1 μL（約10 U）
（3）10×buffer：1或2 μL。
（4）ddH2O：補足20 μL。
2. 混勻，做好標記。
3. 37℃水浴1-3 h。
4. 70℃水浴10 min中止反應。
5. 電泳檢測酶切效果。
四、結果與分析
假若一種酶在環狀質粒DNA中只有一個酶切位點， 且酶切徹底，紫外燈下檢測電泳結果，則單酶切應為一條帶， 而雙酶切則為兩條帶。如果條帶數目多於理論值，那么有可能是酶切不完全。如果酶切結果與酶切前的質粒條帶一樣（超螺旋、線性和開環三條帶），則說明質粒完全沒有被切開。
