轉基因誘導突變是通過遺傳工程的手段對動物基因組的結構或組成進行人為的修飾或改造，並通過相應的動物育種技術使得這些經修飾改造後的基因組在世代間得以傳遞和表現。
基本介紹
- 中文名：轉基因誘導突變
- 基因重複：不破壞原基因鄰近位的基因的結構
- 染色體畸變：重複、倒位、相互易位
- 研究重點：ES細胞體內分化規律
該技術已經被許多國家廣泛用於生產轉基因動物和農作物，轉基因食品在其生產過程和內在品質方面都占有明顯的優勢
將目的基因的DNA片段通過合適的載體或直接導入受體胚胎達到基因的共同表達，培育出符合人們需要的優良品種。
利用這一技術，人們可以在動物基因組的特定位點引入所設計的基因突變，模擬造成人類遺傳性疾病的基因結構或數量異常；可以通過對基因結構進行修飾，在動物發生、發育的全過程研究體內基因的功能及其結構/功能的關係；可以在動物基因組引入病毒基因組以模擬病毒性疾病的發病過程；可以通過引入具有重要藥用價值蛋白的編碼基因，使動物成為該藥物蛋白的生產農場；可以將所引入的DNA片段作為環境誘變劑作用的靶DNA，通過對它回收後的結構分析，研究誘變劑造成DNA損傷和誘發基因突變的規律。轉基因動物技術不僅在生命科學研究中的套用越來越廣，技術本身的發展也越來越快，朝著修飾和精確性與可調性日益逼近。
體系的組成
可以將轉基因動物研究的整個系統歸納為三個部分。
（1）上游部分：克隆目的基因，分析基因的結構並在體外或其他系統中進行功能研究。
（2）中游部分：設計遺傳修飾策略（包括載體系統的構建等），選擇適當的靶細胞進行基因轉移和鑑定，在此基礎上將遺傳修飾由細胞向整體動物過渡，實現對整體動物基因組進行人為修飾的目的。
（3）下游部分；按育種程式進行工程動物的選育和建系，在整體動物的背景上對目的基因的功能進行詳細的研究，並進一步地開發利用符合設計要求的遺傳工程動物。
其中“上游部分”是基礎，根據相關的基顧研究為後續轉基因動物研究提出需解決的問題；“中游部分”是技術的關鍵，也是整個技術體系的核心；而“下游部分”則是目的。近年來以“基因組計畫”為代表的遺傳學研究在認識基因組的結構組成方面正在大步地向前邁進，為通過轉基因動物技術對動物基因組進行修飾提供了堅實、豐富的基礎。
（1）上游部分：克隆目的基因，分析基因的結構並在體外或其他系統中進行功能研究。
（2）中游部分：設計遺傳修飾策略（包括載體系統的構建等），選擇適當的靶細胞進行基因轉移和鑑定，在此基礎上將遺傳修飾由細胞向整體動物過渡，實現對整體動物基因組進行人為修飾的目的。
（3）下游部分；按育種程式進行工程動物的選育和建系，在整體動物的背景上對目的基因的功能進行詳細的研究，並進一步地開發利用符合設計要求的遺傳工程動物。
其中“上游部分”是基礎，根據相關的基顧研究為後續轉基因動物研究提出需解決的問題；“中游部分”是技術的關鍵，也是整個技術體系的核心；而“下游部分”則是目的。近年來以“基因組計畫”為代表的遺傳學研究在認識基因組的結構組成方面正在大步地向前邁進，為通過轉基因動物技術對動物基因組進行修飾提供了堅實、豐富的基礎。
轉基因動物遺傳修飾的策略及其發展
從理論上講，遺傳工程的發展，已有可能運用多種策略在體外培育的哺乳動物細胞中對任何一個或幾個已知基因組結構和DNA序列的位點進行各種類型的遺傳修飾。
導致產生新功能的基因組修飾
（1）普通轉基因：在基因組中轉入一個能有效表達的基因，該基因可以是原基因組所沒有的，也可以是有相應的內源基因的，還可以是結構發生了變化的內源基因等。
（2）：指利用造成基因重複的基因打靶技術，在內源基因的鄰近部位引入一個與內源基因含有相同調控序列的基因拷貝，而且原則上不破壞原基因鄰近位點上的基因的結構。
（2）：指利用造成基因重複的基因打靶技術，在內源基因的鄰近部位引入一個與內源基因含有相同調控序列的基因拷貝，而且原則上不破壞原基因鄰近位點上的基因的結構。
導致功能丟失的基因組修飾（lossoffunction）
（1）插入突變：外源DNA片段在基因組中發生整合後，勢必造成插入位點的基因結構發生變化，如果該位點是某基因的所在位點，造成相應基因的結構破壞而導致的LOF，可以是在進行GOF的轉基因時發生的，也可以是利用插入型載體進行的基因打靶。
（2）大片段缺失突變：利用置換型的基因打靶載體，將內源基因的功能片段用某些選擇基因片段替換而造成LOF的基因打靶方式。
（3）引入點突變：通過基因打靶，可以對基因組中的特定的位點引入單個鹼基置換或幾個鹼基的定向改變。
（4）條件性基因缺失突變：利用位點特異性重組系統，如GreloxP，FLP/FRT系統，通過對造成體內基因打靶的重組酶表達的調控，在特定的組織或不同的發育階段特異性地、或誘導性地害現所要求的遺傳修飾事件，藉以克服某些重要的基因在純合缺失或雜合缺失狀態下的致死效應和生存能力下降的問題。
（2）大片段缺失突變：利用置換型的基因打靶載體，將內源基因的功能片段用某些選擇基因片段替換而造成LOF的基因打靶方式。
（3）引入點突變：通過基因打靶，可以對基因組中的特定的位點引入單個鹼基置換或幾個鹼基的定向改變。
（4）條件性基因缺失突變：利用位點特異性重組系統，如GreloxP，FLP/FRT系統，通過對造成體內基因打靶的重組酶表達的調控，在特定的組織或不同的發育階段特異性地、或誘導性地害現所要求的遺傳修飾事件，藉以克服某些重要的基因在純合缺失或雜合缺失狀態下的致死效應和生存能力下降的問題。
導致基因替換的基因組修飾
基因替換：利用基因打靶技術進行的基因替換，使得替換位點上內源基因被另一個基因取代，使得內源基因丟失的同時，獲得另外一個基因的功能，這種策略通常比較精確，不影響鄰近位點基因的結構。
染色體畸變
利用位點特異性重組系統介導的DNA重組原理，通過對重組酶識別的位點在染色體上位置的控制以及重組酶表達的控制，可以造成各種類型的染色體畸變，如重複、倒位、相互易位等等。
建立轉基因動物途徑及其發展
能否將在細胞中進行的遺傳修飾過渡到整體以及實現向後代的傳遞，主要取決於所進行修飾的細胞類型和與其相應的育種技術。至今為止，能夠被有效地用來進行轉基因動物研究的途徑主要有以下幾條：
（1）受精卵原核顯微注射和育種：以單細胞期受精卵為靶細胞，利用顯微注射技術將構建時的載體DNA直接注射入受精卵的原核，並將受注射的受精卵移入假孕母體輸卵管繼續發育，獲得轉基因動物個體。
（2）胚胎幹細胞（embryonicstemcells，ES）介導的基因轉移和育種；體外培養ES細胞，利用電穿孔等基因轉移技術將載體DNA轉入ES細胞後，在體外經過適當的篩選和鑑定，首選得到符合設計要求的基因組修飾，再將所獲得的ES細胞經過囊胚腔注射等與受體囊胚細胞混合，並移植入假孕母體子宮繼續發育產生嵌合體，通過利用生殖系嵌合子代設計適當的交配育種，獲得純系。
（3）體細胞基因轉移和克隆：以體外培養的哺乳動物體細胞為材料，通過普通的哺乳動物細胞基因轉移技術，獲得相應的經過遺傳修飾的細胞後，直接利用核移植介導的哺乳動物體細胞克隆技術，即將該體細胞的細胞核移入去核的卵細胞中，並將所得細胞移入代孕動物，獲得轉基因動物克隆個體。
（4）精子介導的基因轉移和育種：將精子細胞（通常是滅能後，即細胞膜被破壞後）與轉基因載體DNA混合共浴後，將精子頭部直接注射入卵細胞，經過人工受精的受精卵移入假孕母體輸卵管繼續發育獲得轉基因動物個體。
（1）受精卵原核顯微注射和育種：以單細胞期受精卵為靶細胞，利用顯微注射技術將構建時的載體DNA直接注射入受精卵的原核，並將受注射的受精卵移入假孕母體輸卵管繼續發育，獲得轉基因動物個體。
（2）胚胎幹細胞（embryonicstemcells，ES）介導的基因轉移和育種；體外培養ES細胞，利用電穿孔等基因轉移技術將載體DNA轉入ES細胞後，在體外經過適當的篩選和鑑定，首選得到符合設計要求的基因組修飾，再將所獲得的ES細胞經過囊胚腔注射等與受體囊胚細胞混合，並移植入假孕母體子宮繼續發育產生嵌合體，通過利用生殖系嵌合子代設計適當的交配育種，獲得純系。
（3）體細胞基因轉移和克隆：以體外培養的哺乳動物體細胞為材料，通過普通的哺乳動物細胞基因轉移技術，獲得相應的經過遺傳修飾的細胞後，直接利用核移植介導的哺乳動物體細胞克隆技術，即將該體細胞的細胞核移入去核的卵細胞中，並將所得細胞移入代孕動物，獲得轉基因動物克隆個體。
（4）精子介導的基因轉移和育種：將精子細胞（通常是滅能後，即細胞膜被破壞後）與轉基因載體DNA混合共浴後，將精子頭部直接注射入卵細胞，經過人工受精的受精卵移入假孕母體輸卵管繼續發育獲得轉基因動物個體。
存在的主要問題及研究重點
在克隆技術尚不可能推廣套用的時候，針對轉基因整合的隨機性問題、ES細胞育種的效率低等問題，以及在我國切實建立向動物基因組引入點突變、引入基因重複突變、引入條件性突變等幾種精確修飾基因組的策略，我們擬開展的工作主要包括4個方面：
（1）通過提高ES細胞體外培養技術以及觀察研究ES細胞體內分化規律及其影響因素，來提高ES細胞生殖系嵌合能力。我們試圖通過建立高效表達報告基因（綠色螢光蛋白，GFP）的ES細胞株系和相應的示蹤系統，並利用該ES細胞系來系統研究ES細胞在囊胚腔移植後的分化規律。我們構建了高效表達報告基因GFP的載體，以電穿孔的方式轉入ES細胞，經篩選後得到陽性ES細胞移入小鼠的囊胚中，比較分析了ES細胞移入不同的胚胎髮育期的實驗結果。目前已獲得了嵌合體小鼠，正在對移植ES細胞的分化規律進行分析。
（2）基於HPRT（hypoxanthineguaninephosphoribosyltransferase，次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶）基因位點的轉基因定點整合系統的建立：針對受精卵原核顯微注射法中轉基因隨機整合的缺點，我們曾提出建立“轉基因定向整合系統”。結合基因DNA同源重組的基因打靶原理和位點特異性重組系統介導的重組和受精卵原核顯微注射途徑，來實現GOF的轉基因定向整合。我們設計構建一套通用的將外源基因定向整合於小鼠hprt基因位點的工具載體，擬以與Alzehimer’s病有關的一種cdc2型激酶nck5a基因進行可行性和套用研究，可望得到一條可以用於GOF型轉基因小鼠模型建立的通用系統。
（3）向基因組中引入點突變的基因打靶研究：建立引入點突變基因打靶的技術體系，以精確地再現自然界的基因突變，具有重要的實用意義。我們以與血友病B發生有關的小鼠的凝血因子IX（mfix）基因突變為例進行普通knockout和用“in-and-out”策略在FIX基因組上特定的位點引入微小突變，以精確地模擬自然界的自友病B基因突變，在建立這一策略體系的同時，建立血友病B的模型。
（4）誘導性突變和引入基因重複的基因打靶策略研究：該體系對組織特異性表達的基因功能及基因的數量性狀的研究有重要的意義。我們已經進行了以腦內表達的nck5a基因為靶基因，構建基於位點特異性同源重組的nck5a基因的誘導型基因打靶和引入基因重複的基因打靶，研究神經細胞中蛋白（如tau）磷酸化與神經系統的發育、Alzhiemer病中神經纖絲的纏結等病理改變的發生。
（1）通過提高ES細胞體外培養技術以及觀察研究ES細胞體內分化規律及其影響因素，來提高ES細胞生殖系嵌合能力。我們試圖通過建立高效表達報告基因（綠色螢光蛋白，GFP）的ES細胞株系和相應的示蹤系統，並利用該ES細胞系來系統研究ES細胞在囊胚腔移植後的分化規律。我們構建了高效表達報告基因GFP的載體，以電穿孔的方式轉入ES細胞，經篩選後得到陽性ES細胞移入小鼠的囊胚中，比較分析了ES細胞移入不同的胚胎髮育期的實驗結果。目前已獲得了嵌合體小鼠，正在對移植ES細胞的分化規律進行分析。
（2）基於HPRT（hypoxanthineguaninephosphoribosyltransferase，次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶）基因位點的轉基因定點整合系統的建立：針對受精卵原核顯微注射法中轉基因隨機整合的缺點，我們曾提出建立“轉基因定向整合系統”。結合基因DNA同源重組的基因打靶原理和位點特異性重組系統介導的重組和受精卵原核顯微注射途徑，來實現GOF的轉基因定向整合。我們設計構建一套通用的將外源基因定向整合於小鼠hprt基因位點的工具載體，擬以與Alzehimer’s病有關的一種cdc2型激酶nck5a基因進行可行性和套用研究，可望得到一條可以用於GOF型轉基因小鼠模型建立的通用系統。
（3）向基因組中引入點突變的基因打靶研究：建立引入點突變基因打靶的技術體系，以精確地再現自然界的基因突變，具有重要的實用意義。我們以與血友病B發生有關的小鼠的凝血因子IX（mfix）基因突變為例進行普通knockout和用“in-and-out”策略在FIX基因組上特定的位點引入微小突變，以精確地模擬自然界的自友病B基因突變，在建立這一策略體系的同時，建立血友病B的模型。
（4）誘導性突變和引入基因重複的基因打靶策略研究：該體系對組織特異性表達的基因功能及基因的數量性狀的研究有重要的意義。我們已經進行了以腦內表達的nck5a基因為靶基因，構建基於位點特異性同源重組的nck5a基因的誘導型基因打靶和引入基因重複的基因打靶，研究神經細胞中蛋白（如tau）磷酸化與神經系統的發育、Alzhiemer病中神經纖絲的纏結等病理改變的發生。
