識別人白血病幹細胞新單抗3A4的人源化研究

《識別人白血病幹細胞新單抗3A4的人源化研究》是依託浙江大學，由湯永民擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：識別人白血病幹細胞新單抗3A4的人源化研究
• 依託單位：浙江大學
• 項目負責人：湯永民
• 項目類別：面上項目

項目摘要

白血病幹細胞（leuekemia stem cells, LSC）是存在於病人體內一群微量並能引起白血病耐藥和復發的細胞群，徹底清除LSC是根治白血病的關鍵。本組前期研究發現自製新單抗ZCH-6-3A4能有效識別和靶向殺傷髓系白血病幹細胞及子代白血病細胞。抗體人源化基因改造是研究抗體藥物的必要前提。本研究擬採用一系列分子生物學、全表達基因RNA轉錄組學和NOD/SCID動物模型等體內外實驗技術對該抗體的可變區基因進行克隆、重組並進行人源化改造研究，構建人鼠嵌合型抗體Hm3A4和CDR植入型人源化抗體Hu3A4真核表達載體pHMCH3-Hm3A4和pHuCH3-Hu3A4,並分別轉染至中華倉鼠卵巢細胞（CHO）中進行大量表達，對兩種不同人源化程度工程抗體的生物學特性及靶向殺傷LSC及子代白血病的機制進行深入研究，為進一步研究該抗體藥物奠定堅實的基礎，具十分重要的科學意義和潛在的臨床套用前景。

結題摘要

白血病幹細胞（leukemia stem cell, LSC）是白血病耐藥和復發的根源。靶向LSC的治療策略是當前白血病治療研究的熱點。本研究通過一系列分子生物學技術對自製CD45RA新克隆3A4抗體基因進行人源化改造。結果發現，人鼠嵌合型3A4抗體HmscFv3A4-Fc基因也稱Hm3A4基因能通過自製真核表達載體pHMCH3成功轉染CHO細胞並建株（Hm3A4-CHO），所分泌的抗體能有效識別98%以上的3A4陽性KG1a細胞，親和力常數Ka=1011M-1，抗體阻滯試驗證明Hm3A4能識別與親本鼠源性抗體3A4相同的抗原表位。SDS－PAGE電泳和Western blot分析顯示Hm3A4的分子量為100kDa。殺傷功能實驗證實Hm3A4具有良好的ADCC和CDC作用，在無血清培養條件下Hm3A4-CHO細胞所分泌的抗體量約為2.5μg/ml。進一步人源化改造研究發現，來源於3A4的CDR區直接植入人IgG1 Fab框架模板中被證明無生物學活性。因此，通過EGFP引入scFv3A4通過真核表達載體在CHO中的表達能快速（每輪篩選僅需18小時）篩選到功能良好的人源化抗體。結果表明，在3A4抗體CDR區植入人IgG1 Fab框架區後，對編碼輕鏈和重鏈各7個胺基酸殘基的基因進行回復突變的基因改造能有效保持人源化3A4抗體包括HuscFv3A4-Fc和完整IgG1型人源化3A4抗體Hu3A4的生物學活性，兩種高度人源化（人源化程度93.93%）3A4抗體即Hu3A4（完整IgG1人源化抗體）和HuscFv3A4-Fc融合抗體蛋白基因能成功轉染CHO細胞，並能穩定分泌目的抗體而建株，流式細胞術證實兩種人源化抗體均能識別97％以上的KG1a細胞，兩者的親和力常數分別為Ka=3.7×1010M-1和Ka=4.7×109M-1。抗體阻滯試驗證實它們所識別的抗原表位與親本鼠源性3A4抗體相同。SDS－PAGE和Western－blot實驗證明它們的分子量分別為160kDa和100kDa,具有良好的ADCC作用，但喪失CDC功能。動物模型治療試驗證明，Hu3A4和HuscFv3A4-Fc能有效延長模型鼠（平均105天）壽命，平均成活時間分別為250天和165天（P均＜0.05）。結論：3A4抗體成功人源化，為該抗體進一步開發用於臨床白血病治療試驗奠定了堅實的基礎。