《新單抗ZCH-6-3A4靶向清除髓系白血病幹細胞的實驗研究》是依託浙江大學，由湯永民擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：新單抗ZCH-6-3A4靶向清除髓系白血病幹細胞的實驗研究
- 依託單位：浙江大學
- 項目負責人：湯永民
- 項目類別：面上項目
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
白血病幹細胞(LSC)是白血病復發的根源，徹底殺滅LSC是根治白血病的關鍵。流式細胞術研究表明：自製新單抗ZCH-6-3A4能識別86%-100%的髓系LSC（表型為CD34+CD38-CD123+）及其子代白血病細胞，而不識別正常非造血組織細胞和臨床重要血細胞成分包括中性粒細胞、紅細胞、血小板、原始造血幹細胞，具有良好的靶向性，但該單抗所識別的抗原表位尚未澄清，其免疫毒素能否清除LSC及其程度也未闡明。本項目擬採用一系列細胞/分子生物學技術和動物模型，探索該單抗及其免疫毒素3A4-去甲斑蝥素(3A4-NCTD)靶向清除髓系LSC的作用及其機制，觀察3A4陰陽性細胞組分、3A4-NCTD處理與否在SCID/NOD小鼠體內成瘤情況；採用重組多個重組子細胞系和電腦模擬，澄清該單抗所識別的抗原表位，為3A4靶向清除髓系LSC提供實驗依據，具有十分重要的科學意義和潛在的臨床套用前景。
結題摘要
本研究獲得如下研究結果： 1、3A4單抗較進口CD45RA單抗（L48）具有更強的識別活性，3A4能識別86%-100%的AML-LSC；3A4與復發難治白血病病人樣本呈強陽性，陽性率為（96.96±3.74）%，明顯高於L48（71.04±26.01）%（P=0.016）。 2、純化3A4抗體對AML細胞株KG1a無CDC作用，但具有良好的ADCC作用。 3、NCTD-3A4免疫毒素在體外能有效殺傷KG1a細胞，96h 37C 孵育後殺傷率為61.09%，而對3A4陰性的Nalm-6細胞的殺傷率僅為3.56%。 4、採用組織晶片技術和免疫組織化學染色檢查發現，3A4單抗除識別淋巴結、小腸、脾臟、骨髓等造血組織細胞外，與所有其他正常組織細胞不反應。 5、用KG1a細胞株尾靜脈注射接種NOD/SCID小鼠，成功建立了白血病動物模型，該模型組小鼠（3隻）分別在30、40和51天內發病死亡，而NCTD-3A4治療組分別於接種後122天才死亡，無NCTD偶聯的3A4裸抗體進行治療時，模型鼠分別於139、150、159天內死亡，生存時間明顯長於無治療模型組和NCTD-3A4免疫毒素治療組小鼠。病鼠脫臼致死後病理檢查發現，腦膜及外周血中存在大量白血病細胞浸潤。 6、 成功構建並表達3A4單鏈抗體ScFv3A4，通過構建3A4單鏈抗體-綠色螢光蛋白（ScFv3A4-EGFP）的方法對3A4抗體內化後細胞內的時相定位規律進行觀察，發現37C 孵育0.5h開始內化，3h達高峰，內化率達72.64%。ScFv3A4-EGFP內化後迅速進入溶酶體，56h後在溶酶體中徹底降解。經ScFv3A4-EGFP真核表達載體轉染CHO細胞後抗體產生的時相定位研究發現，融合抗體蛋白在內質網中大量合成，並通過高爾基體分泌至細胞外上清中。 7、通過構建CD45抗原多個剪接體真核表達載體和瞬時表達的方法建立轉染子細胞，並通過流式細胞術檢測3A4抗體所識別的抗原表位，發現3A4抗體所識別的抗原表位為CD45RC。綜上所述，自製新單抗3A4具有良好的識別AML-LSC及子代白血病細胞的作用，在體內外均具有良好的靶向殺傷/治療作用。機制主要通過ADCC及內化免疫毒素NCTD發揮殺傷靶細胞和AML-LSC的作用。為進一步開發該抗體藥物奠定了堅實的實驗基礎。
