《靶向AML-LSC的新型嵌合抗原受體3A4-CAR基因的構建及最佳化》是依託浙江大學，由湯永民擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：靶向AML-LSC的新型嵌合抗原受體3A4-CAR基因的構建及最佳化
- 依託單位：浙江大學
- 項目負責人：湯永民
- 項目類別：面上項目
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
白血病幹細胞（LSC）是該病復發的根源，常規化療多耐藥。CD19-嵌合抗原受體（CD19-CAR）T細胞在克服B系腫瘤耐藥的臨床試驗中獲成功，但用CD45亞類-CAR T細胞靶向AML及其LSC則國內外未見報導。研究發現，新單抗ZCH-6-3A4（簡稱3A4，CD45亞類）能識別初診及復發難治AML及其LSC，有明顯的靶向殺傷/治療作用，但當該抗體經人源化改造後親和力下降。本項目擬構建3A4-CD137-ζ CAR，插入慢病毒載體pELNS後轉染正常人血MNC研製新型CAR-T細胞，通過體外實驗和動物模型鑑定其對AML的靶向殺傷作用。並將iCaspase9自殺基因和/或IL-15基因整合到該CAR結構中，通過比較其擴增、殺傷能力及持續存活時間的變化，進一步最佳化並篩選功能最佳的3A4 CAR。本課題將為3A4-CAR T細胞治療難治性AML奠定基礎，具有十分重要的研究意義和潛在的套用前景。
結題摘要
急性白血病是嚴重威脅人類生命的血液系統惡性腫瘤，雖然聯合化療已經取得了明顯的進步，但仍有20-50%的病例因復發死亡，白血病幹細胞（LSC）是該病復發的根源。近年來，CD19嵌合抗原受體（CD19CAR）T細胞在克服難治性B系腫瘤中獲得巨大成功，但利用該技術靶向AML及其LSC則少見報導。課題組前期研究發現，新單抗3A4能識別90%以上的初診及復發難治性AML及其LSC，有明顯的靶向殺傷/治療作用，但利用CAR細胞技術研究該抗體識別靶點的研究國內外未見報導。本項目通過4年的潛心研究，成功構建並篩選到體內外靶向殺傷/治療人復發難治性AML及其LSC的最佳二代3A4CAR基因，並成功構建了pcDNA3.1真核表達載體（3A4CAR-pcDNA3.1）及慢病毒表達載體(3A4CAR-pLenti)，兩者均能成功轉（感）染人外周血T細胞，其瞬時轉（感）染效率分別為19%和88%，慢病毒載體的轉染效率明顯高於pcDNA3.1載體。慢病毒穩定感染效率為50%~62%。體外實驗證明，3A4CAR-T細胞共孵育5小時對AML細胞株KG1a和病人原代復發難治性白血病細胞的靶向殺傷效率為38%-63%，其殺傷機制是3A4CAR-T細胞通過上調顆粒酶B和釋放CD107a陽性顆粒而發揮靶向殺傷作用。白血病動物模型體內實驗證明，3A4CAR-T細胞能發揮明顯的靶向治療作用，100天AML模型有效率為50%，明顯高於模型鼠和普通T細胞治療組，後兩組小鼠在63天內全部死亡，差異具有顯著意義（p = 0.000）。結論：本項目成功研製最佳化篩選到體內外最佳二代3A4CAR基因；3A4CAR-T細胞體內外均能發揮明顯的靶向殺傷和治療作用。該研究為進一步開發基於3A4的免疫治療奠定了重要的工作基礎，具有重要意義和潛在的臨床套用前景。
