血球計數板

血球計數板是一種常用的細胞計數工具，醫學上常用來計數紅細胞、白細胞等而得名，也常用於計算一些細菌、真菌、酵母等微生物的數量，是一種常見的生物學工具。

基本介紹

• 中文名：血球計數板，又名血細胞計數板
• 外文名：Hemocytometer
• 分類名稱：血細胞分析儀器
• 管理類別：Ⅱ類

基本結構

用優質厚玻璃製成。每塊計數

板由H形凹槽分為2個同樣的計數池。計數池兩側各有一支持柱，將特製的專用蓋玻片覆蓋其上，形成高0.10mm的計數池。計數池畫有長、寬各3.0mm的方格，分為9個大方格，每個大格面積為1.0毫米X1.0毫米=1.0平方毫米；容積為1.0平方毫米X0.1毫米=0.1立方毫米。

其中，中央大方格用雙線分成25箇中方格，位於正中及四角5箇中方格是紅細胞計數區域（圖中淺紅色區域），每箇中方格用單線劃分為16個小方格。四角的4個大方格是白細胞計數區域（圖中淺藍色區域），每個大方格用單線劃分為16箇中方格。根椐國際標準局（NBS）規定，大方格每邊長度允許誤差為±1%。

說明：上圖紅色方框代表一個大方格；綠色方框代表一個中方格，兩種中方格的面積不一樣大；藍色方框代表一個小方格。

計數池分為兩種類型。一種是大方格內分為16中格，每一中格又分為25小格即16 × 25 型（希利格式）；另一種是大方格內分為25中格，每一中格又分為16小格即 25 × 16 型（湯麥式）（如圖1所示）。但是不管計數室是哪一種構造，它們都有一個共同的特點：即每一大方格都是由16×25=25×16=400個小方格組成。

使用血球計數板計數時，先要測定每個小方格中微生物的數量，再換算成每毫升菌液（或每克樣品）中微生物細胞的數量。

在血球計數板上，刻有一些符號和數字，XB-K-25為計數板的型號和規格，表示此計數板分25箇中格（即湯麥式）。計數區邊長為1mm，則計數區的面積為1mm，每個小方格的面積為1/400mm。蓋上蓋玻片後，計數區的高度為0.1mm，所以每個計數區的體積為0.1mm，每個小方格的體積為1/4000mm。

使用方法

1. 視待測菌懸液濃度，加無菌水適當稀釋（斜面一般稀釋100倍），以每小格的菌數可數為度。
2. 取潔淨的血球計數板一塊，在計數區上蓋上一塊蓋玻片。
3. 將菌懸液搖勻，用滴管吸取少許，從計數板中間平台兩側的溝槽內沿蓋玻片的下邊緣滴入一小滴（不宜過多），讓菌懸液利用液體的表面張力充滿計數區，勿使氣泡產生，並用吸水紙吸去溝槽中流出的多餘菌懸液。也可以將菌懸液直接滴加在計數區上（不要使計數區兩邊平台沾上菌懸液，以免加蓋蓋玻片後，造成計數區深度的升高），然後加蓋蓋玻片（勿使產生氣泡）。
4. 靜置片刻，使細胞沉降到計數板上，不再隨液體漂移。將血球計數板放置於顯微鏡的載物台上夾穩，先在低倍鏡下找到計數區後，再轉換高倍鏡觀察並計數。由於生活細胞的折光率和水的折光率相近，觀察時應減弱光照的強度。
5. 計數時若計數區是由16箇中方格組成，按對角線方位，數左上、左下、右上、右下的4箇中方格（即100小格）的菌數。如果是25箇中方格組成的計數區，除數上述四個中方格外，還需數中央1箇中方格的
   菌數（即80個小格）。為了保證計數的準確性，避免重複計數和漏記，在計數時，對沉降在格線上的細胞的統計應有統一的規定。如菌體位於大方格的雙線上，計數時則數上線不數下線，數左線不數右線，以減少誤差。即位於本格上線和左線上的細胞計入本格，本格的下線和右線上的細胞按規定計入相應的格中。見右圖：即本格中計數細胞為3個。
6. 對於出芽的酵母菌，芽體達到母細胞大小一半時，即可作為兩個菌體計算。每個樣品重複計數2-3次（每次數值不應相差過大，否則應重新操作），按公式計算出每mL（g）菌懸液所含細胞數量。
7. 測數完畢，取下蓋玻片，用水將血球計數板沖洗乾淨，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免損壞格線刻度。洗淨後自行晾乾或用吹風機吹乾，放入盒內保存。

血球計數板

計數公式

紅細胞目視計數法的計算公式如下：

紅細胞數(RBCs)/L=N/5×25×10×10^6×200

N為：五個中方格的RBC總數

N/5為：5箇中方格（粉紅色區域）的平均RBC數量（然後推及至中央大方格中每一個中方格RBC的數量）

N/5×25為：中央大方格RBC總數（即：0.1mm²（ul）的RBC總數）

N/5×25×10為：1mm²（ul）RBC總數

N/5×25×10×10^6為：1L的RBC總數

200為：血液的稀釋倍數

公式簡化後：紅細胞數/L=N×5×10×稀釋倍數

公式前面部分都是換算成每微升血多少該計數細胞；最後都是由微升換算到升，乘以10的6次方

1. 目鏡測微尺每格長度=兩個重疊刻度間物鏡測微尺格數×10/兩個重疊刻度間目鏡測微尺格數。
2. 以同樣方法，分別在不同倍率的物鏡下測定測微尺上每格的實際長度。
3. 如此測定後的目鏡測微尺的尺度,僅適用於測定時所用的顯微鏡的目鏡和物鏡的放大倍數。若更換物鏡，目鏡的放大倍數時，必須再進行校正標定。

缺點

利用血球計數板在顯微鏡下能直接數出每個小方格中的微生物的個體數目，根據該小格所占的體積，快速地推算出單位體積的溶液中含有的微生物總數。但若菌懸液中不加可以區分細胞死活的試劑時，計數通常計得的是活菌體和死菌體的總和（有時還有微小雜物），還有微小雜物也被計算在內，這樣得出結果往往偏高，因此此法適用於體積較大的單細胞微生物的計數。

注意事項

1. 鏡檢計數室。因前一次清洗不到位，或者保存過程中存在污染，更或者因操作不當導致的計數室存在劃痕，若不及時清洗或更換，則會對後期實驗計數產生極大影響。所以，在每次使用血球計數板之前都需要加一步鏡檢計數室，如若在鏡檢時發現計數室有污物，則需按要求清洗並吹乾後再進行實驗。
2. 搖勻後取液。在吸出培養液進行計數之前，需輕輕震盪試管，使菌體分布均勻，防止聚沉澱，從而提高計數的代表性和準確性。
3. 先蓋血蓋片後加菌液。在菌懸液搖勻後，應先在血球計數板上蓋上血蓋片，再用滴管吸取少許菌懸液，從計數區中間平台沿血蓋片的上邊緣滴入一小滴菌懸液，利用液體的表面張力一次性充滿計數區。若先加菌液再覆蓋血蓋片，則容易因為菌液加入過多，而導致血蓋片未與血球計數板支持柱接觸，血蓋片浮於菌液上方而導致最後計數偏大，同時會因為有氣泡產生而導致計數偏小。
4. 靜置片刻再計數。靜置5 min，待菌懸液不再漂浮流動，酵母菌全部沉降後再將血球計數板放到顯微鏡下進行計數。先在低倍鏡下找到需要觀察計數的大方格及中方格，將中方格移到視野中央，然後撥動轉換器移至高倍鏡進行計數。
5. 高倍鏡下調亮度。低倍鏡下，用平面鏡和小光圈，可以清晰地看到血球計數板上的酵母菌。但是，撥動轉換器換到高倍鏡後，即使是用了平面鏡和最小光圈，視野里往往還是白茫茫一片，什麼都看不見，這時候可以嘗試操作遮光器上的金屬遮光片進行遮光處理。因為活的酵母菌和培養液的折光率相近，所以要在高倍鏡下將視野調得暗一些。
6. 掌握計數原則。一般選擇觀察的菌液濃度控制在每個小方格內有4或5個菌體為宜，若其濃度太高，可適當稀釋；並採用“計上不計下，計左不計右”的計數原則。

誤差控制

血細胞計數的誤差分別來源於技術誤差和固有誤差。其中由於操作人員採血不順利，器材處理、使用不當，稀釋不準確，細胞識別錯誤等因素所造成的誤差屬技術誤差；而由於儀器（計數板、蓋片、吸管等）不夠準確與精密帶來的誤差稱儀器誤差，由於細胞分布不均勻等因素帶來的細胞計數誤差屬於分布誤差或計數域誤差（filederror）。儀器誤差和分布誤差統稱為固有誤差或系統誤差。技術誤差和儀器誤差可通過規範操作、提高熟練程度和校正儀器而避免或糾正，但細胞分布誤差卻難於徹底消除。因此，搞好紅細胞計數的質量控制一般需採用以下措施。

1．避免技術誤差，糾正儀器誤差

（1）所用器材均應清潔乾燥，計數板、血蓋片、微量吸管及刻度吸管的規格應符合要求或經過校正。①計數板的鑑定：要求計數室的台面光滑、透明，劃線清晰，計數室劃線面積準確。必要時採用嚴格校正的目鏡測微計測量計數室的邊長與底面積，用微米千分尺測量計數室的深度。美國國家標準局（NBS）規定每個大方格邊長的誤差應小於1%，即1±0.01mm，深度誤差應小於2%，即0.1±0.002mm。若超過上述標準，應棄之不用。②血蓋片應具有一定的重量，平整、光滑、無裂痕，厚薄均勻一致，可使用卡尺多點測量（至少在9個點），不均勻度在0.002mm之內。必要時採用平面平行儀進行測量與評價，要求呈現密集平行的直線干涉條紋。最簡單的評價方法是將潔淨的蓋片緊貼於乾燥的平面玻璃上，若能吸附一定的時間不脫落，落下時呈弧線形旋轉，表示蓋片平整、厚薄均勻。同時，合格的蓋片放置在計數室表面後，與支持柱緊密接觸的部位可見到彩虹。精選出的蓋片與其他蓋片緊密重合後，在掠射光線下觀察，如見到完整平行的彩虹條紋表示另一枚蓋片質量也符合要求。③臨床實驗室多採用一次性微量採血管採集毛細血管血，除注意定點購買使用信譽較好廠家的產品外，還應對每一批量的採血管進行抽樣檢查，可通過水銀稱重法或有色溶液比色法進行校正，誤差不應超過±1%。

（2）紅細胞稀釋液應等滲、新鮮、無雜質微粒。

（3）嚴格操作，從消毒、採血、稀釋、充池到計數都應規範，尤其應注意的是血樣稀釋及充池時既要作到充分混勻，又要防止劇烈震盪為破壞紅細胞。必須一次性充滿計數室，防止產生氣泡，充入細胞懸液的量以不超過計數室台面與血蓋片之間的矩形邊緣為宜。

（4）報告法定計量單位。

2．縮小計數域誤差及分布誤差

縮小計數域誤差或分布誤差由於血細胞在充入計數室後呈隨機分布或稱Poisson分布（），而我們所能計數的細胞分布範圍是有限的，由此造成的計數誤差稱為計數域誤差或分布誤差。縮小這種誤差的有效方法就是儘量擴大細胞計數範圍和計數數目，一般先進行誤差估計，然後決定所需計數的數目和計數範圍，只要能將誤差控制在允許範圍內即可。

Berkson指出，當使用同一支吸管、同一面計數室，計數0.2mm2面積的細胞數，有望將CV控制在可接受的7%以內。對於紅細胞計數而言，由於紅細胞數量較多，在計數室中顯得比較“擁擠”，根據Poisson公式推斷。欲將誤差控制在變異百分數5%以內，至少需要在計數室中計數400個紅細胞，因此要求計數五個中方格的紅細胞。事實上Berkson還通過實驗證明，紅細胞的計數域誤差為s=0.92，較理論誤差（Poisson分布誤差）要小。

3．降低異常標本的干擾誤差

排除異常標本的干擾白細胞數量在正常範圍時，相對於紅細胞數量來講，其影響可忽略，但如白細胞過高（>100×10/L），則應對計數結果進行校正。方法是：①實際RBC=計得RBC-WBC。如當紅細胞換算後為3.5×10/L、白細胞換算後為100×10/L時，病人實際紅細胞數應為3.4×10/L。②在高倍鏡下計數時，避開有核細胞。有核細胞體積比正常紅細胞大，中央無凹陷，無草黃色折光，可隱約見到細胞核。此外，當病人急性嚴重貧血時網織紅細胞可提前大量釋放，也給紅細胞計數帶來一定的干擾，而且影響網織紅細胞絕對值計算結果。其校正方法有待探討。