比色法(colorimetry)是通過比較或測量有色物質溶液顏色深度來確定待測組分含量的方法。早在公元初古希臘人就曾用五倍子溶液測定醋中的鐵。1795年，俄國人也用五倍子的酒精溶液測定礦泉水中的鐵。但是，比色法作為一種定量分析的方法，大約開始於19世紀30～40年代。這是利用有色物質對特定波長光的吸收特性來進行定性分析的一種方法，其原理是基於被測物質溶液的顏色或加入顯色劑後生成的有色溶液的顏色，顏色深度和物質含量成正比，則根據光被有色溶液吸收的強度，即可測定溶液中物質的含量。如利用光電效應，將透過有色溶液後的光強度成正比例地變換為電流的強度來進行比色定量的方法，稱為光電比色法。
基本介紹
- 中文名：比色法
- 外文名：colorimetry
- 常用方法：顯色反應
- 基本反應：有色化合物有恆定的組分
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定義
以生成有色化合物的顯色反應為基礎，比色分析對顯色反應的基本要求是：反應應具有較高的靈敏度和選擇性，反應生成的有色化合物的組成恆定且較穩定，它和顯色劑的顏色差別較大。選擇適當的顯色反應和控制好適宜的反應條件，是比色分析的關鍵。
常用方法
常用的比色法有兩種：目視比色法和光電比色法，兩種方法都是以朗伯-比爾定律(A=εbc)為基礎。常用的目視比色法是標準系列法，即用不同量的待測物標準溶液在完全相同的一組比色管中，先按分析步驟顯色，配成顏色逐漸遞變的標準色階。試樣溶液也在完全相同條件下顯色，和標準色階作比較，目視找出色澤最相近的那一份標準，由其中所含標準溶液的量，計算確定試樣中待測組分的含量。
與目視比色法相比，光電比色法消除了主觀誤差，提高了測量準確度，而且可以通過選擇濾光片來消除干擾，從而提高了選擇性。但光電比色計採用鎢燈光源和濾光片，只適用於可見光譜區和只能 得到一定波長範圍的複合光 ， 而不是單色光束，還有其他一些局限，使它無論在測量的準確度、靈敏度和套用範圍上都不如紫外-可見分光光度計。20 世紀30～60年代，是比色法發展的旺盛時期，此後就逐漸為分光光度法所代替。
常用的比色法有兩種：目視比色法和光電比色法，前者用眼睛觀察，後者用光電比色計測量，兩種方法都是以朗伯－比爾定律（見紫外-可見分光光度法）為基礎。
目視比色法
常用的目視比色法是標準系列法，該法採用一組由質料完全相同的玻璃製成的直徑相等、體積相同的比色管，按順序加入不同量的待測組分標準溶液，再分別加入等量的顯色劑及其他輔助試劑，然後稀釋至一定體積，使之成為顏色逐漸遞變的標準色階。再取一定量的待測組分溶液於一支比色管中，用同樣方法顯色，再稀釋至相同體積，將此樣品顯色溶液與標準色階的各比色管進行比較，找出顏色深度最接近於樣品顯色溶液的那支標準比色管，如果樣品溶液的顏色介於兩支相鄰標準比色管顏色之間，則樣品溶液濃度應為兩標準比色管溶液濃度的平均值。標準系列法的主要優點是設備簡單和操作簡便，但眼睛觀察存在主觀誤差，準確度較低。
光電比色法
與目視比色法相比，光電比色法消除了主觀誤差，提高了測量準確度，而且可以通過選擇濾光片和參比溶液來消除干擾，從而提高了選擇性。光電比色計和紫外－可見分光光度計的光路結構非常相似，它們之間所不同的地方在於：①分光光度計採用稜鏡或光柵作色散元件，因而可以得到純度較高的單色光束。而光電比色計採用濾光片，只能得到一定波長範圍的光譜帶(複合光)；②紫外－可見分光光度計採用紫外和可見區的光源，即氫燈和鎢燈，而光電比色計只用一種鎢燈光源，因而前者適用於紫外－可見光譜區，而後者只適用於可見光譜區；③紫外－可見分光光度計可以測定待測組分的精細吸收光譜，不僅可用於定量分析，而且可以作有機化合物的定性和結構分析，而光電比色計只能作定量分析。此外，分光光度計一般都採用靈敏度高的光電倍增管作檢測器，而光電比色計一般用光電池或光電管作檢測器。因此，光電比色計無論在測量的準確度、靈敏度和套用範圍上都不如紫外－可見分光光度計。
在20世紀30～60年代，是比色分析發展的繁盛時期，它廣泛用於冶金、地質、金屬材料中微量的金屬和部分非金屬元素的測定。隨著光學儀器製造技術的發展，紫外－可見分光光度計套用日益普及，精密度較高而價格又較低的紫外－可見分光光度計已逐漸代替光電比色計，分光光度法也隨之逐漸代替了比色法。
儀器
最早套用目視比色法，由於用肉眼觀察顏色的深淺誤差較大，以後改用光電比色計進行測定，光電比色法是利用光電池或光電管測量透過有色溶液後的光亮度，測定時需要放置濾光片，誤差較大。多採用具有分光系統(單色器)及檢測器的分光光度計，使測定結果準確、省時，選擇性好。
比色分析表示
在比色分析中，當入射光亮度一定時，液層厚度保持不變，則測得的吸光度A與溶液的濃度c成直線關係。在實際套用時，首先選擇被測物質溶液的最大吸收波長(λmax)，在最大吸收波長時進行比色，靈敏度，然後配製一系列不同濃度的標準溶液，在一定條件下進行顯色，分別測定它們的吸光度，將測得的吸光度與濃度的關係作圖，得到一條直線，稱為標準曲線。測定未知試樣時，應在與繪製標準曲線相同的條件下進行顯色，測定其吸光度，從標準曲線上查得試樣的濃度。
基本反應c
反應應具有較高的選擇性，即選用的顯色劑只與待測組分反應，而不與其他干擾組分反應或其他組分的干擾很小；
反應生成的有色化合物有恆定的組分和較高的穩定性；
反應生成的有色化合物有足夠的靈敏度，摩爾吸光係數一般應在104以上；
反應生成的有色化合物與顯色劑之間的顏色差別較大，它們的最大吸收濃度之差一般應在60納米以上。選用的顯色劑可以是一種試劑，也可以是兩種不同的試劑。如果待測組分與兩種不同的試劑反應生成一種有色化合物，則稱為三元絡合物顯色反應。這類顯色反應常常具有更高的靈敏度和選擇性，在比色法和紫外-可見分光光度法中套用非常普遍。選擇適當的顯色反應，研究最合適的反應條件和消除干擾的方法是比色分析的關鍵問題。溶液的酸度、顯色劑的用量、溫度、溶劑等對顯色反應都有影響。
套用
農藥的比色測定有三種類型： ①農藥有效成分本身帶有顏色，可以直接進行比色。如敵磺鈉原藥為黃棕色，在波長435納米處有最大吸收峰，但這種類型的農藥較少; ②經化學反應可以生成有色化合物。如對硫磷，經鹼解後形成對硝基酚而呈黃色，可在420～480納米波長範圍內測量吸光度。③引入顯色基團生成有色化合物。如農藥經醇、鹼水解產生酚類或芳胺，可與偶氮試劑進行偶合形成有色化合物。例如氨基甲酸酯的甲萘威等，經鹼解後生成α-萘酚與對硝基苯偶氮硼氟酸甲醇溶液反應，形成黃色可以在590納米處測定吸光度。
意義
測定柿葉中總黃酮的含量
利用黃酮類化合物可與金屬離子形成有色螯合物的原理，建立柿葉中總黃酮含量測定方法，並且對供試品製備方法進行選擇。通過正交試驗設計選取供試品製備條件，採用分光光度法，KAc-AlCl3體系與供試品中黃酮提取物反應，選擇最大吸收波長，以蘆丁為對照品製作標準曲線，並做方法學考察。供試品製備:提取液70%乙醇溶液，提取時間75 min，供試品與乙醇溶液的固液比為1∶50(g/mL)，用KAc-AlCl3體系比色法測定供試品柿葉中總黃酮含量為1.13%，重複性RSD=1.86%(n=6)，平均回收率為99.23%，RSD=0.27%(n=5)。KAc-AlCl3體系比色法測定柿葉中總黃酮含量的方法可行，呈色穩定，操作簡便，可作為柿葉中總黃酮的含量測定方法，並可以做為快速測定方法套用於生產中對總黃酮含量的監控。
測土壤脲酶活性
土壤脲酶活性的測定有多種方法，其中靛酚藍比色法由於測量結果精確性較高，重現性較好，套用最為廣泛。但也有培養后土壤過濾液渾濁、帶色、脲酶活性受底物濃度影響較大等缺點。以此方法為基礎，針對過濾方式、培養時間、底物濃度及緩衝液選擇等4個重要參數進行了對比試驗，以期進一步改進靛酚藍比色法的測定準確性。結果表明，培養時選擇5%的底物濃度、pH10.0的硼酸鹽緩衝液、培養24h後再經KCl溶液浸提過濾比色測定，其結果比傳統靛酚藍比色法高約2.46倍，改良靛酚藍比色法的測定結果更接近土壤真實脲酶活性。
