基本介紹
- 中文名：咔唑比色法
- 適用領域：測定果膠的含量
- 性質：顯色反應
- 反應顏色：紫紅色
- 檢測波長：530nm
- 特點：簡單，快速，靈敏
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實驗器材
儀器
分光光度計，恆溫水浴鍋
試劑
(1) 95%乙醇或無水乙醇。
(2) 70%乙醇。
(3) 乙醚。
(4) 0.05mol/L鹽酸溶液。
(5) 0.5mol/L氫氧化鈉溶液。
(6) 0.15%咔唑試劑
稱取化學純咔唑0.15g，溶解於精製乙醇中，並定容到100mL。咔唑溶解緩慢，需加以攪拌。
(7) 精製乙醇
取無水乙酵或95%乙醇1000mL，加入鋅粉4g，硫酸(1：1) 4mL，在水浴中回流10h，用全玻璃儀器蒸餾，餾出液每1000mL加鋅粉和氫氧化鉀各4g，重新蒸餾一次。
(8) 半乳糖醛酸標準貯備溶液
準確稱取半乳糖醛酸100mg，溶於蒸餾水並定容到100mL，得濃度為1 mg/mL半乳糖醛酸標準貯備液。
(9) 半乳糖醛酸標準工作液
分別準確吸取0mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL、6.0mL、7.0mL半乳糖醛酸標準貯備溶液於8個100mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，得一組濃度分別為0mg/L、10mg/L、20mg/L、30mg/L、40mg/L、50mg/L、60mg/L、70mg/L的半乳糖醛酸標準工作液。
(10) 濃硫酸優級純。
(11) 甲基紅指示劑。
實驗步驟
樣品處理
(1) 新鮮樣品稱取試樣30～50g，用小刀切成薄片，置於預先放有無水乙醇的500mL錐形瓶中。裝上回流冷凝器，在水浴上沸騰回流15min後，冷卻。用布氏漏斗過濾，殘渣移至研缽中，一邊慢慢磨碎，一邊滴加70%的熱乙醇，冷卻後再過濾，反覆操作至濾液不呈糖的反應(用苯酚一硫酸法檢驗)為止。殘渣用無水乙醇洗滌脫水，再用乙醚洗滌以除去脂類和色素，漏斗中殘渣在空氣中揮發去乙醚。
(2) 乾燥樣品 研細，過60目篩，取5～10g樣品於燒杯中，加入熱的70%乙醇，充分攪拌以提取糖類，過濾。反覆操作至濾液不呈糖的反應。殘渣用無水乙醇洗滌，再用乙醚洗滌，最後讓乙醚揮發掉。
提取果膠
(1) 水溶性果膠提取用150mL水將上述揮發至乾的殘渣移人250ml燒杯中，加熱至沸並保持沸騰1h，隨時補足蒸發的水分，冷卻後移入250mL容量瓶中，加水定容，搖勻，過濾，棄去初濾液，收集濾液即為水溶性果膠提取液。
(2) 總果膠的提取用150mL加熱至沸的0.05mol/L鹽酸溶液把揮乾的殘渣移入250mL錐形瓶中，裝上冷凝器，於沸水浴中加熱回流1h，冷卻後移入250mL容量瓶中，加甲基紅指示劑2滴，加0.5mol/L氫氧化鈉中和後，用水定容，搖勻，過濾，收集濾液即為總果膠提取液。
(3) 標準工作曲線的製作取8支50mL比色管，各加入12mL濃硫酸，置冰水浴中，邊冷卻邊緩緩依次加入濃度為0mg/L、10mgL/、20mg/L、30mg/L、40mg/L、50mg/L、60mg/L、70mg/L的半乳糖醛酸標準溶液2mL，充分混合後，再置冰水浴中冷卻。然後在沸水浴中準確加熱10min，用流動水迅速冷卻到室溫，各加入0.15%咔唑試劑1mL，充分混合，置室溫下放置30min，以0號管為空白在530nm波長下測定吸光度，繪製標準工作曲線。
(4) 測定取果膠提取液，用水稀釋到適當濃度(含半乳糖醛酸10～70mg/L)。取2mL稀釋液於50mL比色管中，以下按製作標準曲線的方法操作，測定吸光度。從標準曲線上查出半乳糖醛酸濃度(mg/L)。
計算
計算公式如下：
式中X—樣品中果膠物質(以半乳糖醛酸計)的質量分數，%；
c—從標準曲線上查得的半乳糖醛酸濃度，mg/L；
V—果膠提取液總體積，mL；
K—提取液稀釋倍數；
m—樣品質量，g。
注意事項
(1) 糖分的存在對咔唑的呈色反應影響較大，使結果偏高，故樣品處理時應充分洗滌以除去糖分。
(2) 檢驗糖分的苯酚一硫酸法：取檢液1mL，置於試管中，加入5%苯酚水溶液1mL，再加入硫酸5mL，混勻，如溶液呈褐色，證明檢液中含有糖分。
(3)硫酸的濃度對呈色反應影響較大，半乳糖醛酸在低濃度的硫酸中與咔唑試劑的呈色度極低，甚至不顯色，只有在濃硫酸中才可使其顯色，且顏色深淺與濃硫酸濃度和純度有關。故在測定樣液和製作標準曲線時，應使用同規格、同批號的濃硫酸，以保證其濃度、純度一致。
(4 )本法的測定結果以半乳糖醛酸表示，因不同來源的果膠中半乳糖醛酸的含量不同，如甜橙為77.7%，檸檬為94.2%，柑橘為96%，蘋果為72%～75%。若把結果換算為果膠的含量，可按上述關係計算換算係數。
