螢光素漏出試驗( the fluorescein leakage test, FLT)是歐洲近年發展的評價兔眼刺激性的一種替代方法，它通過檢測暴露於受試物後滲透過培養的單/多層細胞螢光素量來評價受試物的刺激性，並用於評價受試物對細胞屏障功能的影響。FLT在歐洲獲得了大量的驗證研究，被認為是一極有意義的試驗方法。
基本介紹
- 中文名：螢光素漏出試驗
- 外文名： the fluorescein leakage test, FLT
- 公式計算：FL(% )=(m-y)/(z-y)×100%
- 個刺激性等級：2~10 g/100 ml為中刺激
前期準備,計算公式,
前期準備
FLT方法與結果判定
確定MDCK細胞生長融合後,於細胞生長培養膜內單層細胞表面加入0.4 ml受試物, 15 min後用Hank′s液輕柔沖洗細胞表面以清除受試物,再將細胞生長培養膜放入每孔含0.5 ml新鮮配製Hank′s液的培養板中,加入0.4 ml濃度為10μg/ml螢光素鈉溶液, 37℃培養30 min後以螢光分光光度計檢測滲透入培養板中的螢光素量(激發光波長485 nm,發射光波長530 nm)。然後,清洗細胞生長培養膜,置於另一含有新鮮培養液的培養板上,於37℃繼續培養4 h後,再次加入螢光素鈉溶液,同法檢測以了解受試物對細胞緊密連線的影響。如此,依次檢測24 h和72 h受試物對細胞的影響。
計算公式
按以下公式計算引起螢光素漏出百分比:
FL(% )=(m-y)/(z-y)×100%
m表示各受試物各濃度螢光素漏出量均值, y表示無受試物對照組螢光素漏出量均值(陰性對照), z表示無細胞培養對照組螢光素漏出量均值(陽性對照)。
計算接觸受試物後引起20%螢光素漏出的實驗物質濃度FL20(g/100 ml),並根據4 h結果FL20H4將受試物分為3個刺激性等級,其中FL20H4>10 g/100 ml為無/輕刺激、2~10 g/100 ml為中刺激、<2 g/100 ml為重/極重刺激。
