蛋白激酶C-δ的促腎間質纖維化作用及其機制的研究

《蛋白激酶C-δ的促腎間質纖維化作用及其機制的研究》是依託武漢大學，由李曉寧擔任項目負責人的青年科學基金項目。

基本介紹

• 中文名：蛋白激酶C-δ的促腎間質纖維化作用及其機制的研究
• 項目類別：青年科學基金項目
• 項目負責人：李曉寧
• 依託單位：武漢大學

項目摘要

腎間質纖維化(RIF)的機制尚不完全明了。蛋白激酶C-δ（PKC-δ） 可被血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)激活，參與調控缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)表達，參與某些與上皮細胞-間充質細胞轉化(EMT)相關的事件。申請人前期研究發現PKC-δ促進細胞凋亡。RIF與凋亡、EMT等相關。但PKC-δ是否促進RIF，國內外未見報導。本研究在體外用Ang Ⅱ刺激大鼠腎小管上皮NRK-52E細胞，觀察Ang Ⅱ/PKC-δ/HIF-1α信號通路對腎小管上皮細胞EMT的影響，並利用PKC-δ負顯性突變株質粒和化學抑制劑Rottlerin阻斷該信號通路，抑制EMT；在體內用PKC-δ抑制肽和Rottlerin抑制單側輸尿管梗阻小鼠腎臟PKC-δ活性，減少梗阻後細胞凋亡和EMT，減輕RIF。從而從體外實驗和體內實驗兩方面證實PKC-δ的促RIF作用，闡明其機制，為RIF藥物治療提供新的方向和理論與實驗依據。

結題摘要

目的：明確PKC-δ的促腎間質纖維化（RIF）作用和PKC-δ抑制肽δ V1-1和PKC-δ化學抑制劑Rottlerin的抗RIF作用，研究Ang II/ PKC-δ/ HIF-1α促RIF信號通路，以及該通路對腎小管EMT的調控，闡明PKC-δ的促RIF作用機制。方法：在體外，用AngⅡ刺激NRK-52E細胞，RT-PCR、Western blot、免疫螢光等方法觀察細胞內α-SMA、E-cadherin、HIF-1α的表達，用Rottlerin抑制PKC-δ活性，以觀察AngⅡ/PKC-δ/HIF-1α信號通路對腎小管上皮細胞EMT的影響。在UUO小鼠體內，腹腔注射δ V1-1和Rottlerin，TUNEL染色觀察細胞凋亡；Masson’s染色觀察纖維化；RT-PCR、Western blot及免疫組化觀察EMT標誌物α-SMA和E-cadherin的mRNA和蛋白表達；Western blot檢測腎臟PKC-δ活性；免疫組化方法觀察TGF-β1蛋白表達；觀察PKC-δ基因敲除的UUO小鼠和野生型小鼠梗阻後7天和14天腎臟纖維化程度。結果：體外實驗： AngⅡ刺激後NRK-52E細胞α-SMA的mRNA和蛋白表達增加，E-cadherin的mRNA和蛋白表達減少，EMT發生。PKC-δ抑制劑Rottlerin可抑制Ang II誘導的EMT。AngⅡ刺激後NRK-52E細胞內HIF1-α mRNA表達升高，Rottlerin抑制其表達。體內試驗：TUNEL染色證實梗阻後凋亡，Masson’染色證實梗阻後RIF，免疫組化結果顯示α-SMA蛋白表達增加及E-cadherin蛋白表達減少。Rottlerin組、抑制肽δ V1-1組小鼠腎臟組織小管細胞凋亡和RIF程度較UUO組均明顯減輕，EMT減少。TGF-β1蛋白表達在各組間無明顯差異。PKC-δ基因敲除小鼠UUO後RIF程度較野生型小鼠明顯減輕。結論：本研究從體內和體外證實PKC-δ參與RIF的發生和發展，PKC-δ的促纖維化作用是通過促進腎小管上皮細胞EMT實現，可能存在Ang II/ PKC-δ/ HIF-1α促RIF的信號通路，且是一條與經典TGF-β1通路無關的新通路。PKC-δ抑制劑Rottlerin和抑制肽δ V1-1可以抑制上述通路，並最終抑制RIF，為RIF藥物治療提供了新的方向和理論與實驗依據。