基本介紹
- 中文名：蔗糖密度梯度離心
- 用途：純化
- 對象：細胞質膜
- 分類：等用兩相分配法
套用方法,離心方法,純化方法,用途,
套用方法
離心方法
蔗糖密度梯度離心，將禽腦脊髓炎病毒（AEV）L2Z株、Van Roekel株和1143株分別經卵黃囊接種6日齡SPF雞胚，接毒後，以4500r/min離心及胰腺，用玻璃勻漿器製成10%的組織懸液。組織懸液經3次反覆凍融後，以4500r/min離心15min，取上清液。而後用氯仿處理，取水相，經冷凍真空濃縮，進行不連續蔗糖密度梯度離心。取出含AEV的組分，用PBS稀後超速離心除去蔗糖。亦稱平衡密度梯度離心法。用超離心機對小分子物質溶液，長時間加一個離心力場達到沉降平衡，在沉降池內從液面到底部出現一定的密度梯度。若在該溶液里加入少量大分子溶液，則溶液埋葛元內比溶劑密度大的部分就產生大分子沉降，比溶劑密度小的部分就會上浮，最後在重力和浮力平衡的位置，集聚形成大分子帶狀物。
利用這種現象，測定核酸或蛋白質等的浮游密度，或根據其差別進行分析的一種沉降平衡法。自1958年米西爾遜（M．Meselson），斯塔爾（F．W．Stahl），維諾格拉德（J．Vinograd）成功地分離了〔15N〕DNA和〔14N〕DNA以來，該法取得許碑埋凳肯多成果。為得到必要的濃度梯度，多採用濃氯化銫溶液，所以有時也使用氯化銫濃度梯度離心法這個名稱，還可採用氯化銣、溴化銫等溶液。通常利用分析超高速離心機，但在將細胞顆粒成分進行分離等以純化為目的的情況，利用密度差，使用分離超高速離心機，採用預先製備好的蔗糖等的密度梯度。〔2〕採用蔗糖等一些小分子溶液，預先在分離超離心機的樣品地內製備出密度梯度，在其上面再加上一層少量的大分子溶液後，離心，大分子就形成層狀而沉降。若含有沉降係數不同的許多成分，就會出現許多層。這種情況採用適當的編排號碼，取出樣品旋射巴池內的溶液，然後進行研究。
純化方法
純化病毒常用的方法是蔗糖密度梯度離心法，能得到束章拳比較純的病毒。其過程如下：
1、將收集的組織或臟器或其他,用玻璃勻漿器充分研磨後製成懸液,經反覆凍融3 次後,置- 20 ℃冰櫃中,備用。
2、先以5000g離心15分鐘後，獲取上清夜，然後再20000g高速離心30分鐘後取上清液。
3、接著10萬g超速離心2h，將沉澱用少量STE溶解。
4、先在超速離心管中加入5-8mL的第3步所獲取的含病毒樣品的溶解液，然後在離心管中依次加入30 % , 45 % , 60 %的蔗糖,加的時候是用長針頭從底部往上加的。11萬g離心2.5h,發現在30 %與45 % 以及45 % 與60 %之間都有一條明亮的帶，用長針頭將兩條不同部位的帶都吸取出來，分別收集到不同的瓶內。
5、去蔗糖；用STE緩衝液適量稀釋純化的病毒，然後11萬g離心3h,用少量STE（根據沉澱的量決定加入多少）緩衝液把沉澱懸起，即最後獲得了純化的病毒。-20度凍純備用，用時可用分光光度計測定其病毒含量。
