脂肪幹細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）、ADSC多能細胞是近年來從脂肪組織中分離得到的一種具有多向分化潛能的幹細胞。主要恢復組織細胞的修復功能，促進細胞的再生，恢復年輕面容的同時，身體機能也得到充分改善，有效改善亞健康、早衰等疾病，由內而外真正的有效抵抗衰老。
基本介紹
- 中文名：脂肪幹細胞
- 外文名：adipose-derived stem cells
- 又名：adsc脂肪多能細胞
- 優點：具有自我更新能力
- 結果：在體外穩定增殖且衰亡率低
主要特點,材料方法,幹細胞,組織工程,相關研究,套用,研究對象,
主要特點
研究發現ADSCs細胞能夠在體外穩定增殖且衰亡率低，同時它具有取材容易、少量組織即可獲取大量幹細胞，適宜大規模培養，對機體損傷小等優點，而且其來源廣泛，體內儲備量大，適宜自體移植，逐漸成為近年來新的研究熱點之一。
傳統的脂肪移植手段由於存在免疫排斥、炎症反應等缺陷難以得到讓人滿意的療效。據統計，自體脂肪組織移植到缺損部位後，通常其中40%~60%會被吸收。通過患者自身的脂肪組織內的幹細胞，來構建具有完整生物學結構和功能工程脂肪組織無疑將是解決這一難題的最佳方案。如何實現從幹細胞到脂肪細胞的分化，是構建工程脂肪組織不可迴避的問題。早在 2001 年，Zuk 等人發現脂肪幹細胞以來，就已經證明脂肪幹細胞具有向脂肪、軟骨、成骨、成肌等多向分化潛能。傳統的成脂誘導分化採用的方法多為混合誘導劑法。成脂誘導劑的不足是帶有毒性，對人體有較大危害。
除了以上通過誘導劑進行體外誘導分化外，用成熟體細胞與幹細胞共培養同樣可以使幹細胞定性誘導分化。2000 年， Maurin 等採用間接共培養的方式，研究脂肪細胞對成骨細胞擴增和活性的影響，並證明成熟脂肪細胞對人的成骨細胞的擴增有抑制作用;但對成骨基質細胞的擴增及活性，無顯著影響。2003 年Shigehisa 等採用三維膠原凝膠中共培養脂肪細胞和內皮細胞的方式研究二者間的相互作用，得出結論：內皮細胞參與到脂肪組織形成和擴增的過程當中。2007 年， Wang 等通過實驗證明，鼠來源脂肪幹細胞在膠原凝膠三維體系中，與OECs (Olfactory ensheathing cells-嗅鞘細胞)共培養過程中，能夠分化成為OECs-like(嗅鞘樣細胞)。
綜上所述，通過共培養方式體外誘導幹細胞定向分化已經成為研究熱點。因此，本研究嘗試採用trans-well 間接共培養方式，對人體吸脂來源的幹細胞與脂肪細胞進行共培養，並對比傳統成脂誘導劑法，考察共培養條件下幹細胞成脂分化的效果。
材料方法
1.1 實驗儀器與材料
倒置螢光顯微鏡(IX71, Olympus);數字彩色攝像系統(Sony3CCD);圖像分析軟體(Image-pro-plus);離心機(Z23, Herm 德國);Transwell (3450-clear, corning, Costar 美國);純水機(Millipore-Q-Synthesis, Millipore Ltd.法國);六孔板(Corning Incorporated 3516, Costar 美國)。
實驗所採用的脂肪組織均來源於大連沙醫生美容醫院，並徵得患者同意。
1.2 脂肪細胞培養
將吸脂來源的脂肪組織用D-Hanks 沖洗，去除殘留的血細胞和組織碎片，把脂肪組織放入離心管中，記錄原始體積。向組織中加入等體積的0.1%Ⅰ型膠原酶，放入37℃氣浴振盪器中消化30 min。然後將消化好的組織靜置5 min，待其分層後，用吸管吸取位於懸液上層的脂肪細胞，將含有脂肪細胞的懸液以1000 r/min(167g)，離心2 min 後棄掉下層懸液得到脂肪細胞。
1.3 脂肪幹細胞的分離和培養
參照文獻，同上述脂肪細胞的分離一樣，將脂肪組織沖淨，稱重後消化。當消化完成後，棄掉上層未消化的脂肪組織，將下層的細胞懸液以1500 r/min(375g)，離心10 min 後棄上清，得到離心管底部的脂肪幹細胞團，將其重懸，密度調整到1×105mL-1，然後接種在培養面積為25 cm2 的細胞培養瓶中。
當幹細胞長滿培養瓶後按一傳二進行傳代，具體的傳代方法是：首先，用D-Hanks 沖洗一遍細胞，然後加入2 mL 的混合酶溶液(0.25%胰酶和0.02%EDTA)消化，當在顯微鏡下觀察到細胞發生明顯的變形，縮成球狀後，立即用含有10%胎牛血清的培養基中止消化，並用吸管輕輕吹打瓶底部，確保細胞完全脫落分離到懸液中，再把細胞懸液置於離心機上，以1000 r/min (167g)，離心5 min。最後，將離心得到的細胞團重懸，調整密度為合適密度進行接種。
將準備好的脂肪幹細胞和脂肪細胞分別置於Transwell 的上室和下層中，脂肪幹細胞與脂肪細胞的個數之比分別為1:5，1:1，2:1 和5:1(4 組分別命名為A、B、C 和D 組)進行共培養，其中每孔中脂肪細胞的數量均為1×105 個。以上每組均做平行實驗(n=3)。
1.5 成脂誘導對照實驗
將幹細胞以1.5×105 每孔的密度接種在六孔板中，以正常培養基培養的樣本為成脂分化實驗陰性對照組，以成脂誘導培養基培養的樣本為陽性對照組。具體方法是：向基礎培養基(DMEM+10%胎牛血清)中加入1 μmol/L 的地塞米松、10 μmol/L 的胰島素、200 μmol/L 的吲哚美辛和0.5 mmol/L 的異丁基甲基黃嘌呤，配製成脂誘導培養基，每周換2 次液，直到進行成脂染色觀察為止，以上對照組均做平行實驗(n=3)。
用 0.5%油紅O，對成脂誘導後的各組樣本進行染色。具體操作方法是：先用D-hanks將樣本細胞沖洗充分，然後加入油紅稀釋染色10~15 min，(油紅O 稀釋液配製方法:0.5%飽和油紅O 原液按3:2(油紅O:蒸餾水)加入蒸餾水，然後過濾，待用)，接下來用75%的乙醇溶液將樣本分化至間質清晰，然後蒸餾水沖，最後再用台盼藍對脂質以外的細胞核部分進行復染，並於100 倍鏡下觀察拍照。以每組樣本隨機選取5~10 視野進行拍照觀察以考察共培養方法的成脂誘導分化效果。
1.7 流式檢測
1.8 Hoechst/PI 死活染色
棄掉舊培養基，用D-Hanks 沖洗除去殘留培養基然後向每個Transwell 孔中加入質量濃度為1 mg/mL 的Hoechst 33342 大約10 μL，使其終質量濃度為10 μg/mL，37℃下避光反應10 min。待Hoechst 染色完成後，用D-Hanks 沖洗除淨殘餘的Hoechst 染料接下來，再加入用PI 染液，使其終質量濃度為10 μg/mL，4 ℃下避光反應15 min，染色完成也用D-Hanks沖淨殘餘染液最後，將染好的細胞置於倒置螢光顯微鏡下觀察、拍照。
2 結果與討論
所示的脂肪細胞，與文獻中描述的脂肪細胞相一致，圖中所示的脂肪幹細胞與文獻中描述的相一致。均形態完整，生長狀態良好，適合進行共培養的後續研究。為成脂誘導陰性對照組，表明脂肪幹細胞不能自發生成脂質;圖為成脂陽性對照組，在成脂誘導劑作用下，脂肪幹細胞能夠生成脂質，經統計約有20.3%的脂肪幹細胞發生了成脂分化。為共培養後脂肪幹細胞染色圖片，其中脂肪幹細胞與脂肪細胞之比分別為1:5，1:1，2:1 和5:1(其中每孔中的脂肪細胞數均為1×105 個)，儘管在不同比例下對脂肪幹細胞和脂肪細胞進行tranwell 間接共培養，然而經過8 天共培養後，脂肪幹細胞並不能象成脂陽性對照組那樣產生脂質油滴。
此實驗結果的原因可能是由於共培養的持續時間過短所致。據文獻報導，成脂誘導分化的持續時間通常在1~2 周，即7~4d 左右。因此，有可能由於本實驗中脂肪細胞與脂肪幹細胞共培養時間過短，導致脂肪幹細胞與脂肪細胞沒能得到充分作用，所以不能實現成脂誘導分化。
基於上述分析，需延長共培養時間至20d，進一步考察共培養方式中幹細胞成脂分化的可行性。
為脂肪細胞與脂肪幹細胞經過20d 共培養後脂肪幹細胞的Hoechst/PI 死活染色結果。Hoechst 染料對活的細胞具有特異性染色的特點，PI 則對死細胞特異性染色。從中可以看到，兩組中的細胞均呈明亮的藍色，說明細胞的活性很好。基本上看不到PI 染成紅色的死細胞的存在。表明，本實驗中，經過共培養後的脂肪幹細胞，仍擁有良好的活性。
研究可以發現，共培養組a，d，g 3 組均未發生明顯的成脂分化現象。通過觀察b，e，h 3 幅圖發現，經過成脂誘導劑誘導的3 個不同接種密度的陽性對照組中均出現成脂分化，圖中可以看到成脂分化後的細胞內出現大量密集在一起的小脂滴，當小脂滴達到一定數量後，就會聚合成為較大脂滴。這些成脂分化的現象與文獻中報導的脂肪幹細胞成脂分化的過程相一致。通過觀察c，f，i 3 組未加任何誘導劑，僅僅使用基礎培養基培養的脂肪幹細胞的陰性控制對照組，可以看到，脂肪幹細胞均勻生長於培養界面上，經過20d 的培養細胞的生長狀態良好，未發生明顯細胞破碎和衰退死亡的改變。
a，b，c 和d 為各個共培養組的對照組的流式結果圖，圖e，f，g 和h 為共培養20d 後，脂肪幹細胞的表面標記表達流式檢測結果。
通過以上分析發現(f,g)，經過共培養的脂肪幹細胞，其表面抗原CD105的表達發生明顯的降低，其結果接近不表達。CD105作為間充質細胞特異表達的表面抗原發生這一改變意味著，脂肪幹細胞在共培養過程中可能發生了一定程度上的分化。
3 結 論
採用人體吸脂來源的幹細胞與脂肪細胞進行共培養，8d 之內不能促使脂肪幹細胞成脂分化。且將共培養時間延長至20d 後，仍未能觀察到脂肪幹細胞發生明顯的成脂分化現象。通過流式細胞儀對共培養的脂肪幹細胞進行細胞表面抗原標記表達的分析，發現共培養後脂肪幹細胞與非共培養對照組相比較，其中間充質細胞特異性表達標記CD105 發生明顯降低，這就意味著本實驗的共培養過程中，脂肪幹細胞內部已發生一定程度的改變。
幹細胞
幹細胞是具有自我複製和多向分化潛能的原始細胞，是生命的起源細胞，是形成人體各種組織器官的原始細胞。幹細胞技術是生物治療的前沿技術，稱之為再生醫學。幹細胞是具有自我複製和多向分化的原始細胞，是機體的起源細胞，是形成人體各種組織器官的原始細胞。
幹細胞是一類具有自我更新能力的多潛能細胞，在一定條件下，它可以分化成多種功能細胞或組織器官，醫學界稱其為“萬用細胞”。幹細胞是指尚未分化的細胞，存在於早期胚胎、胎盤及其附屬物、骨髓、外周血和成年組織中，它能夠被培養成肌肉、骨骼和神經等200多種人體細胞、組織和器官。幹細胞技術最顯著的作用就是：能再造一種全新的、正常的甚至更年輕的細胞、組織和器官。
組織工程
以面向國際，立足本土為宗旨，力爭辦成傳播組織工程領域一流學術研究成果的受專業讀者認可和喜歡的業界期刊。 雜誌發表關於乾細胞培養與移植、組織構建、材料生物相容性、硬組織植入物、軟組織移植物以及計算機輔助數位化技術的套用基礎及臨床研究，轉化醫學和偱證醫學研究，發表中國組織工程研究領域一流水平的學術、技術創新成果。 雜誌始終堅持追求高質量審稿，承諾短周期出版的特色，堅持線上投稿、審稿、修稿的全程線上快速運營，堅持出版文章紙媒體輔以更多延伸閱讀內容網路發布，以便於讀者理解和感興趣。
期刊簡介
雜誌的主編
王岩， 教授， 解放軍總醫院， 研究方向為骨科
中華醫學會骨科分會主任委員，全軍骨科專業委員會主任委員、亞太關節外科學會（APAS）主席、解放軍總醫院骨科主任，主任醫師、 博士生導師。
1997年創刊，周刊，每年出版53期。
《中國組織工程研究》雜誌的宗旨為面向國際，立足本土，力爭辦成傳播中國組織工程領域一流學術研究成果和受中國組織工程研究領域專業讀者認可的國際化學術期刊。
曾用刊名
《現代康復》1997-2001年
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《中國組織工程研究與臨床康復》2006-2011
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《中國組織工程研究》2012
刊號：ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R
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套用
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