基本介紹
- 中文名：綠色螢光蛋白
- 外文名：Green fluorescent protein
- 領域：生物學，光學
簡介,發展歷史,結構,套用,螢光顯微鏡,參見,
簡介
綠色螢光蛋白(Green fluorescent protein，簡稱GFP)，是一個由約238個胺基酸組成的蛋白質，從藍光到紫外線都能使其激發，發出綠色螢光。雖然許多其他海洋生物也有類似的綠色螢光蛋白，但傳統上，綠色螢光蛋白（GFP）指首先從維多利亞多管發光水母中分離的蛋白質。這種蛋白質最早是由下村脩等人在1962年在維多利亞多管發光水母中發現。這個發光的過程中還需要冷光蛋白質水母素的幫助，且這個冷光蛋白質與鈣離子可產生互動作用。
在維多利亞多管發光水母中發現的野生型綠色螢光蛋白，395nm和475nm分別是最大和次大的激發波長，它的發射波長的峰點是在509nm，在可見光譜中處於綠光偏藍的位置。綠色螢光蛋白的螢光量子產率（QY）為0.79。而從海腎(sea pansy)所得的綠色螢光蛋白，僅在498nm有一個較高的激發峰點。
在細胞生物學與分子生物學中，綠色螢光蛋白(GFP)基因常用做報告基因(reporter gene)。綠色螢光蛋白基因也可以克隆到脊椎動物(例如:兔子)上進行表現，並拿來映證某種假設的實驗方法。通過基因工程技術，綠色螢光蛋白(GFP)基因能轉進不同物種的基因組，在後代中持續表達。現在，綠色螢光蛋白(GFP)基因已被導入並表達在許多物種，包括細菌，酵母和其他真菌，魚（例如斑馬魚），植物，蒼蠅，甚至人等哺乳動物的細胞。
發展歷史
1962年，已經有文獻報導科學家從多管水母屬的發光型水螅水母（luminous hydromedusan Aequorea）中提取到了具有生物發光性質的蛋白質。到了上世紀70年代，對生物發光的現象才有了一些新的進展。有科學家研究了多管水母屬生物發光系統的分子內能量轉移。到了九十年代初，科學家才克隆到GFP的cDNA，並且研究了其表達的胺基酸序列，發現 gfp 10 cDNA 編碼238個胺基酸肽段。研究A. victoria GFP 基因克隆，發現GFP基因上面有三個限制性酶切位點。這對後續科學家了解其結構有很大的幫助。
1994年2月，M. Chalfie 等人創造性的將GFP分別在Escherichia coli和Caenorhabditis elegans細胞中表達，並得出結論由於GFP發光並不需要其他底物或者共同作用因子，所以GFP的表達可以用來在活體中監測基因表達和蛋白質的定位。從那以後的一段時間內，有無數的研究者投入到GFP相關的研究。就在 M. Chalfie 的報導過去一個月左右，Tsuji 等人就在E. coli中融合表達了GFP 蛋白，並且 GFP 在生物體中的激發光譜和發射光譜與自然條件下沒有明顯區別。由於 GFP 在生物體中的螢光強度不夠強，因此很難套用到實際的科學研究中。1995年，Tsien 等人提升了 GFP 發光強度，極大的推動了 GFP 在生物學研究的套用。緊接著在1996年8月 F. Yang 等人就解析出了GFP的分子結構，GFP蛋白是圓桶狀，由11個β-摺疊形成外周，裡面有一個α-螺旋，圓桶的兩端是一些不規則捲曲。同年9月，Tsien 等人就解析出了GFP的晶體結構，並闡明其發光原理。還有一些科學家通過製造突變體來篩選更優的GFP，比如：對pH敏感的GFP、專門套用於植物細胞研究的GFP，等等。除了最佳化GFP之外，很多科學家開拓思維，將GFP蛋白的套用推廣到很多研究領域，2002年，David A. Zacharias 等人就將GFP蛋白套用到膜蛋白的研究。同年，GFP蛋白甚至被做成了Zn生物探測器。
結構
野生型綠色螢光蛋白，最開始是 238 個胺基酸的肽鏈，約 25KDa。然後按一定規則，11 條β-摺疊在外周圍成圓柱狀的柵欄；圓柱中，α-螺旋把發色團固定在正幾乎中心處。發色圖被圍在中心，能避免偶極化的水分子、順磁化的氧分子或者順反異構作用與發色團，致使螢光猝滅。
螢光是螢光蛋白最特別的特點，而其中的發色團起著主要的作用。在 α-螺旋上的 65、66、67位胺基酸——絲氨酸、酪氨酸、甘氨酸經過環化、脫氫等作用後形成發色團。有意思的是，發色團形成過程是由外周柵欄上的殘基催化，底物只需要氧氣。這暗示綠色螢光蛋白被廣泛用於不同物種的潛力：在不同物種中能獨立表達成有功能的蛋白，而不需要額外的因子。不過，現在依然在討論準確的過程。
發色團上的共軛 π鍵能吸收激發光能量，在很短的時間後，以波長更長的發射光釋放能量，形成螢光。
套用
由於螢光蛋白能穩定在後代遺傳，並且能根據啟動子特異性地表達，在需要定量或其他實驗中慢慢取代了傳統的化學染料。更多地，螢光蛋白被改造成了不同的新工具，既提供了解決問題的新思路，也可能帶來更多有價值的新問題。
螢光顯微鏡
主條目：螢光顯微鏡
GFP和它的衍生物的可用性已經徹底重新定義螢光顯微鏡，以及它被用來在細胞生物學和其他生物學科的方式。其中，最令人興奮的就是用於超分辨顯微鏡成像。
參見
- 分子與細胞生物學主題
- 生物學主題
- pGLO
