硬骨魚類雌性性別決定和分化的分子機制研究

《硬骨魚類雌性性別決定和分化的分子機制研究》是依託西南大學，由周林燕擔任項目負責人的青年科學基金項目。

基本介紹

• 中文名：硬骨魚類雌性性別決定和分化的分子機制研究
• 項目類別：青年科學基金項目
• 項目負責人：周林燕
• 依託單位：西南大學

項目摘要

Rspondin(Rspo1)信號通路在哺乳動物雌性性別決定和分化過程中有重要作用。然而該信號通路在魚類性別決定和分化過程中作用的研究尚未見報導。我們首次提出Rspo1信號通路在硬骨魚類雌性性別決定和分化過程中有重要作用。本項目將以羅非魚和青鱂為研究對象，利用實時定量PCR、原位雜交和免疫組化等方法研究Rspo1信號通路基因的時空表達模式。通過激素處理研究Rspo1信號通路和雌激素合成的關係。並通過基因突變（XX）和過表達（XY）等實驗從失活和獲得基因功能兩個方面研究Rspo1信號通路在硬骨魚類雌性性別決定中的功能。通過螢光素酶報告基因分析研究Rspo1信號通路調控雌激素合成的關鍵轉錄因子和生殖細胞減數分裂相關因子的分子機制。最終闡明硬骨魚類Rspo1信號通路通過與雌激素合成協同作用，並通過調節生殖細胞減數分裂啟動，進而在硬骨魚類雌性性別決定和分化過程中發揮重要作用。

結題摘要

由於大部分魚類存在性別二態性，因而其經濟價值、生長速度、養殖效益、觀賞價值等也存在性別差異，因此對魚類性別決定機制和性別控制的研究是水產養殖領域重要組成部分。Rspo1/β-catenin信號通路在哺乳動物雌性性別決定和分化過程中有重要作用。然而該信號通路在魚類性別決定和分化過程中作用的研究尚未見報導。我們以羅非魚和鯖鱂為實驗材料，緊緊圍繞Rspo1/β-catenin這一信號通路在硬骨魚類雌性性別決定與分化中的作用機制開展工作。我們通過對TopFlash載體離體細胞培養實驗，驗證了魚類Rspo1能夠通過β-catenin1激活下游TCF/TEF 靶基因，證明魚類Rspo1/β-catenin可能具有保守的調節機制。通過Rspo1/β-catenin通路抑制劑羅非魚DKK-1重組蛋白對孵化後3個月卵巢的離體處理，發現該通路的抑制導致雄性通路基因的表達上調，而雌激素合成酶基因cyp19a1a基因的表達被抑制。採用最新的基因敲除技術（TALEN和CRISPR/Cas9），在羅非魚成功實現Rspo1/β-catenin信號通路關鍵分子的基因敲除。發現Rspo1或者β-catenin基因在XX個體的敲除，在孵化後2、3個月都出現卵巢分化的延遲和阻滯，嚴重影響卵原細胞的增殖和減數分裂啟動過程，並且雌激素合成酶基因Cyp19a1a的表達和雌激素合成水平顯著下降。同時，雄性特異基因如：amh，gsdf和cyp11b2在敲除XX個體的表達顯著增加。通過H.E.染色，免疫組化和EIA等方法深入研究了基因敲除突變體對性腺形態，內分泌合成和分子水平的影響。同時通過轉基因過表達青鱂Rspo1等實驗，發現Rspo1基因在XY個體的過量表達，能導致其完全性逆轉為可育雌性。同時發現雌性特異基因（foxl2, cyp19a1a等）的表達上調，而雄性特異基因（dmrt1, gsdf等）的表達下降。同時發現從孵化後0天開始，雄激素testerone的合成水平下降，相反雌激素的合成水平顯著升高。總之，本項目深入研究了Rspo1/β-catenin在硬骨魚類雌性性別分化中的作用和分子機制。