基本介紹
- 中文名：甲基香草酸
- 類型：香料
- 用途：食品的調味劑
- 簡介：合成很多藥物和化工產品的原料
簡介,材料與方法,菌種及其製備,設備與儀器,結果與討論,發酵提取和樣品製備,HCB?01712?2的理化性質,結構解析,HCB?01712?2化合物結構確定,
簡介
香草酸甲酯還是合成很多藥物和化工產品的原料和前體物質。目前，絕大多數香草酸甲酯來源於化學合成，少量取自植物，香草酸甲酯也是許多葡萄酒的主要揮發性香味成分，是釀酒酵母或其它細菌將葡萄中含有的香草酸甲酯葡萄糖苷類物質水解後釋放出來的重要香味成分。本研究從12株不同麥角菌(Claviceps sp.)中分離選育，得到一株麥角菌HCB?01712，它能產生化合物HCB?01712?2，該化合物經紫外、質譜及核磁共振分析，確定其化學結構為香草酸甲酯。
材料與方法
菌種及其製備
菌種 麥角菌(Claviceps)HCB?01712，上海來益生物藥物研發中心提供。
斜面(%) 馬鈴薯提取物20，葡萄糖2，酵母粉0.15，瓊脂2，pH6.0。
種子培養基(%) 蔗糖1.5，檸檬酸三鈉0.25，CaCl2·2H2O 0.1，KH2PO4 0.5，MgSO4·7H2O 0.02,酵母粉0.01，NH4NO3 0.2，FeSO4·7H2O 0.0007，ZnSO4·7H2O 0.0006，氨水調pH至6.1。
發酵培養基(%) 蔗糖30，檸檬酸1.5，KH2PO4 0.05，MgSO4·7H2O 0.05， 酵母粉0.01，KCl 0.012，FeSO4·7H2O 0.0007，ZnSO4·7H2O 0.0006，氨水調pH至5.2。
採用二級發酵，將冷凍管接種於斜面培養基，24℃培養4～6d，以孢子懸液形式接種於種子培養基，24℃培養4d，轉接於發酵培養基，24℃培養7d。
設備與儀器
N?1001型旋轉蒸發儀由上海愛朗儀器有限公司生產；核磁共振儀Varian?Inova?400；質譜儀Q?Tof micro YAO19；紫外及HPLC使用Agilent公司DE11108479泵和DAD檢測器。柱層析矽膠為山東黃海化學試劑廠產品，薄層層析板為Merck公司生產的GF254矽膠板。所用試劑為分析純。香草酸甲酯標準品為Across公司生產的methyl vanillate(≥99%)。
結果與討論
發酵提取和樣品製備
取麥角菌HCB?01712菌絲浸泡液經旋轉蒸發儀(N?1001型)濃縮，以丙酮∶石油醚(10∶1)溶解，拌入適量矽膠(200～300目)，乾燥後裝入已用石油醚∶丙酮(100∶1)預先平衡好的矽膠柱中，用石油醚∶丙酮(10∶1)系統恆定洗脫，分部收集，每個流分約10ml，收集合併第18～21流分，濃縮蒸乾，得到HCB?01712?2粗品Ⅰ。
發酵上清液用乙酸乙酯萃取，所得萃取相經旋轉蒸發儀(N?1001型)濃縮，得濃縮液。將濃縮液直接上矽膠層析柱，以石油醚∶丙酮(50∶1)，石油醚∶丙酮(10∶1)以及石油醚∶丙酮(9∶1)進行梯度洗脫，分部收集，每個流分約10ml，合併第6～23流分，經濃縮結晶得到HCB?01712?2粗品Ⅱ。
將HCB?01712?2粗品Ⅰ和Ⅱ合併，得到粗品Ⅲ，將粗品Ⅲ加入已用石油醚∶丙酮(100∶1)預先平衡好的矽膠柱(40cm×1.5cm)中進行第二次層析分離，梯度洗脫，洗脫系統為石油醚∶丙酮(100∶1)，石油醚∶丙酮(50∶1)，石油醚∶丙酮(40∶1)；收集第16～22餾分，合併濃縮後得到黃色油狀物質(樣品Ⅳ)，經HPLC分析，HCB?01712?2的純度在95%以上。
樣品Ⅳ經製備高效液相進一步純化，濃縮乾燥得白色固體，供精密波譜分析和化學結構確定，其HPLC純度分析見Fig.1。
HCB?01712?2的理化性質
該化合物為白色粉末，易溶於乙醇或丙酮等有機溶劑，難溶於甲醇，不溶於水。
結構解析
(1)紫外吸收特徵 HCB?01712?2化合物的紫外吸收波長為220、 265和295nm(Fig.2)， 其中220nm吸收值最大，與標準品香草酸甲酯的特徵吸收一致。
(2)ESI?MS檢測結果 根據ESI?MS圖中183.09(M+H)和205.07(M+Na)峰，可判定該化合物分子量為182。該分子量與香草酸甲酯的分子量相同。
(3)NMR分析結果 HCB?01712?2的1H?NMR圖中有3個烯氫質子δ7.55(1H，d)、6.93(1H，d)和7.63(1H，dd)，依次對應於2、5和6位碳；2個甲基δ3.88(3H，s)和3.94(3H，s)含有6個碳甲基質子，分別對應於8和9位碳；4位碳上的羥基質子對應於δ5.96(1H，bs)(Tab.2)。結果與香草酸甲酯的結構相符。
HCB?01712?2的13C?NMR(400MHz，CDCl3)譜中含有9個碳原子，其中有2個甲基碳原子δ51.85和56.18，4個烯碳原子δ122.45、111.91、114.12和124.28， 1個羰基碳原子δ166.83和1個連氧碳原子結果與香草酸甲酯相一致。
HCB?01712?2化合物結構確定
根據理化性質、紫外、質譜、氫譜和碳譜以及碳氫相關譜的綜合分析，並參照文獻報導數據進行對比，確定HCB?01712?2化合物為香草酸甲酯(Fig.3)。
