溶葡球菌酶(Lysostaphin)是一種含Zn的金屬蛋白酶，具有內切肽酶活性，能特異性水解細菌細胞壁肽聚糖五甘氨酸肽鍵橋（第2與第3位Gly形成的肽鍵），從而快速溶解細菌細胞壁而產生破壁溶菌作用。溶葡萄球菌酶的理化性質、抗菌作用機制以及體內外藥效學等己被廣泛研究。大量研究結果表明溶葡萄球菌酶具有特異性高、殺菌速度快和不易誘導耐藥性等特點。上世紀八十年代以後，國、內外研究人員利用基因重組技術將此酶成功表達於多種工程菌並實現產業化，解決了溶葡萄球菌酶規模化生產的問題，為臨床藥用研究提供了物質基礎。目前，溶葡萄球菌酶主要套用在醫藥、美妝、食品、黏膜消毒、口腔護理、私護、獸藥、寵物護理等領域。
基本介紹
- 中文名：溶葡萄球菌酶
- 外文名：Lysostaphin
- 分子量：27KD
- 等電點：9.6
- 水溶性：溶於水
- 外觀：白色或微白色粉末
- 套用：醫藥、美妝、食品、黏膜消毒、口腔護理、私護、獸藥、寵物護理等領域
簡介,理化性質,殺菌機制,酶學性質,酶活測定方法,刺激性試驗,皮膚刺激試驗,陰道黏膜刺激試驗,皮膚變態反應試驗,溶葡萄球菌酶套用研究進展,
簡介
1964年Schindler和Schuhar首次從Staphylococcus simulans biovar Staphylolyticus（NRRLB-2628）培養上清中發現並分離了一種新的細菌素——溶葡萄球菌酶。它是一種由質粒編碼的、胞外分泌的蛋白酶，前溶葡萄球菌酶原（preprolysostaphin）由493個胺基酸組成（Uniprot:P10547），通過信號肽序列（aa.1-23）將溶葡萄球菌酶原分泌至細胞外，再經過胞外巰基蛋白酶加工去除N-端前肽序列（由多個13 aa重複序列組成）釋放成熟的溶葡萄球菌酶（含246個胺基酸），成熟溶葡萄球菌酶比酶原溶菌活性高4.5倍。
理化性質
溶葡萄球菌酶純品呈針狀結晶，普通凍乾品為白色或淡棕色粉末，易溶於水。成熟的溶葡萄球菌酶由246個胺基酸組成的單鏈分子，結合一個鋅離子，分子量為27KD。Zn為必需的輔助因子。它含有兩個獨立的結構域（N-端的催化區和C-端的細胞壁結合區），由一段長為17aa的柔性Linker連線。溶葡萄球菌酶的胺基酸組成中缺少含硫胺基酸，鹼性和醯胺類胺基酸的比例高於酸性胺基酸，Ph在10.4~11.4之間，偏鹼性條件下活性較高。等電點在9~10之間。
溶葡萄球菌酶的熱穩定性較好，在50℃水溶液中保溫20分鐘酶活性無明顯變化；以凍乾粉形式可長期保存（4℃保存2年，抗菌活性保持90%以上），目前，國內已有企業解決溶葡萄球菌酶在水溶性下的穩定保存，並保持抗菌活性。MgCl2、CaCL2、BaCl2和MnCl2可降低酶活性，推測這些二價陽離子影響了酶與鋅離子的結合。
殺菌機制
溶葡萄球菌酶屬於水解酶中的內切肽酶，能夠快速水解細胞壁肽聚糖，其酶解作用位點是肽聚糖中五甘氨酸肽鍵橋的第2與第3位或者第3與第4位甘氨酸之間形成的肽鍵。由於Gly五肽橋五膚橋聯結構主要存在於葡萄球菌細胞壁，溶葡萄球菌酶只是針對細胞壁具有這種結構的細菌，所以只能裂解革蘭陽性菌細胞壁，使其死亡。
酶學性質
溶葡球菌酶具有多個催化活性中心，其中內切肽酶、糖苷酶和醯胺酶3個活性域與水解細菌胞壁肽聚糖交聯結構的催化活性有關以內切肽酶活性最為重要。除作用於細菌胞壁外，溶葡球菌酶還具有結合併降解彈性蛋白質（elastin）的作用，彈性蛋白質的胺基酸序列中約1／3為gly，但溶葡萄球菌酶降解彈性蛋白質的特異性不同於水解肽聚糖gly五肽橋聯的活性，對前者的特異性與N端的Ala-Ala-Thr-His-Glu 序列與有關，後者的特異活性域則偏C 端。
酶活測定方法
文獻報導的溶葡萄球菌酶酶活性測定方法主要有比濁法、比色法和6-甘氨酸底物法。
比濁法是最常用的一種方法，也是Sigma和AMBI公司採用的方法。檢測時可將金黃色葡萄球菌的新鮮培養物懸於緩衝液中，溶葡萄球菌酶作用過程中定量的降低菌液的濁度，濁度下降值與酶量成正比，通過測定吸光度下降值可計算出樣品中的酶活性。比濁法的缺點是: ① 檢測中使用的底物為金黃色葡萄球菌菌體細胞，使用周期短、穩定性較差，尤其是需使用活金黃色葡萄球菌，存在一定的安全隱患; ② 檢測限不能滿足要求，反應體系中酶的終濃度在0.4～2.0U/mL時線性關係好，折算到檢測樣品的濃度最低要達到2 U/mL，不符合消毒劑實際需要。
6-甘氨酸底物法是將乙醯化的6-甘氨酸肽作為底物，引入顯色基團，通過發色反應，測量光密度值計算酶活性。但是6-甘氨酸底物法試劑製備複雜、檢測時間長( 母液需平衡8周，正式使用的底物仍需在使用前至少平衡4周)，難以在實際工作中推廣使用。
比色法以偶聯活性艷藍染料KNＲ的金黃色葡萄球菌細胞壁肽聚糖( KNＲ-PG) 為色源底物，酶反應過程中將帶有KNＲ 染料基團的小分子可溶性片段產物定量地釋放出，比色測定除去未反應的不溶性底物後的上清液，計算酶活性。比色法有效克服了比濁法的缺點，底物可進行大批量的製備，製備好的底物可以於4 ℃長期保存放置，穩定性好，安全性高; 比色法線性範圍的下限也明顯低於比濁法。
2019年頒發的《溶葡萄球菌酶和溶菌酶消毒劑衛生要求》行業標準（WS/T 647-2019）採用比色法測定溶葡萄球菌酶生物活性，並開展了方法學驗證。反應體系中酶終濃度在0.02 ～ 0.1 U/mL範圍內具有很好的線性，相關係數＞99.9%；回收率高，同一樣品不同濃度的總平均回收率為102.3%，變異係數為4.74%; 精密性高，同一試驗內不同濃度樣品測定的變異係數＜10%，多次試驗間不同濃度樣品測定的變異係數＜10%，不同實驗室間的測定誤差小，變異係數＜5%。
刺激性試驗
國內研究機構利用基因工程技術在大腸桿菌中分泌表達出重組溶葡萄球菌酶（rLysostaphin），用於皮膚黏膜、陰道及各類傷口創面的治療，已取得國家食品藥品監督管理局治療用第I類生物製品臨床試驗批文（批文號2005L03961）。為研究該酶的安全性，研究者對重組溶葡萄球菌酶進行了皮膚刺激、陰道黏膜刺激、皮膚變態反應試驗。
皮膚刺激試驗
完整皮膚組和破損皮膚組的重組溶葡萄球菌酶給藥部位皮膚(左側)和生理鹽水對照部位(右側)均未發現有紅斑和水腫形成，按規定評分標準為O分；亦朱發現色素沉著，藥源性出血及皮膚粗糙等異常反應。受試動物的活動、採食、飲水、排糞、排尿、體重及外觀等亦米出現異常。按照國家有關皮膚刺激性試驗皮膚反應評分及反應強度評價標準，重組溶葡萄球菌酶對新撕蘭兔完整皮膚和破損皮膚，均無刺激性反應。
陰道黏膜刺激試驗
用藥期間，染毒組和對照組大鼠、家兔全身狀況均朱見異常，陰道口也未見明顯充血、紅腫及異常分泌物流出。肉眼觀察取出的陰道組織，各組均朱見陰道黏膜充血、水腫及出血點，陰道黏膜刺激指數在O～0．4，受試物對人鼠、家兔陰道黏膜刺激強度為無刺激性。
皮膚變態反應試驗
重組溶葡萄球菌酶組與生理鹽水對照組豚鼠皮膚在致敏和激發各時間點均未出現紅斑、水腫，皮膚刺激反應的積分均為0，致敏率為0％。
溶葡萄球菌酶套用研究進展
1964年，Schindler和Schudardt首先從Staphylococus Simulans（NRRLB—2628）株的培養物中發現，並證明對“五肽的甘醯鍵”具有斷裂作用。
1964年，《美國藥品及化學品百科全書》第11版5513號將溶葡萄球菌酶編號為MI.11.5513。
1965年，Browder HP 等於1965年在研究中發現溶葡萄球菌酶除具有肽鏈內切酶活性外，還具有醯胺酶和糖苷酶活性。
1972年，Zygmunt WA已經開始了溶葡萄球菌酶對感染性疾病治療方面的研究。
1986年，復旦大學溶葡萄球菌酶課題組於利用基因重組技術，將該溶葡萄球菌酶基因轉進球狀芽孢桿菌等宿主菌中，獲得高分泌、高效、高穩定的表達菌株，建立了該酶的分離純化技術，經過純化首次獲得該酶的結晶。 這項研究成果於1990年12月通過上海市科委和上海市教委組織的鑑定，與會專家一致認為，此項目部分研究工作達到國際先進水平，國家鑑定評價為達到國際先進水平。
1987年，Recsei等通過分子克隆方法將溶葡萄球菌酶基因在大腸桿菌、枯草芽孢桿菌及球形芽孢桿菌中進行表達。
1999年，國內科研人員研製的以溶葡萄球菌酶為核心成份的生物消毒劑，用於燒傷創面的消毒清創，控制燒傷創面金黃色葡萄球菌感染。
2005年，上海高科聯合生物技術研發有限公司首個獲得“溶葡萄球菌酶”一類新藥臨床試驗批件。
2014年，“國家一類新獸藥重組溶葡萄球菌酶粉的技術開發與產業化”榮獲江蘇省科技進步二等獎，治療奶牛的急、慢性子宮內膜炎，臨床、隱性乳房炎，可顯著降低治療乳區所泌乳汁的體細胞數（近80%），可以增加泌乳量5%左右。
