游離脂肪酸含量

游離脂肪酸含量是指原料經粉碎等處理後，用索氏抽提器等技術用無水乙醚等做溶劑提取油脂，提取的油脂經不同方法的測定得到的浸出油中油酸的質量百分含量即為游離脂肪酸含量。最常見的測定游離脂肪酸含量的方法是採用滴定法測定。

基本介紹

• 中文名：游離脂肪酸含量
• 外文名：free fatty acids content

滴定法

方法原理

將樣品溶解在混合試劑中，用標準的氫氧化鉀溶液滴定存在的游離脂肪酸。

試劑

乙醚；

95%乙醇；

0.1mol/L氫氧化鉀標準溶液：按GB/T601製備標定。

中性混合試劑：乙醚+95%乙醇，1+1（V+V）

指示劑：1%酚酞乙醇溶液

方法

參照表1稱取試樣注入錐形瓶中，加入中和的混合溶劑100mL，加入酚酞指示劑0.5mL，用0.1mol/L氫氧化鉀溶液滴定至粉紅色（持續30sec）。

結果計算

式中：V——所用標準氫氧化鉀溶液的體積，mL；

C——所用標準氫氧化鉀溶液的濃度，mol/L

56.1——氫氧化鉀摩爾質量，g/mol

m——試樣的質量，g

近紅外光譜法

儀器與試劑

Antaris II FT-NIR 型光譜儀，配TQ Analyst 8,、Result Integrantion 和Result Operation軟體

酚酞-乙醇溶液：10g/L

中性混合試劑：乙醚95%（體積分數）乙醇體積1:1組成的混合溶液。

儀器工作條件

樣品台溫控模組溫度設定為60℃， 60選擇透射掃描模式，掃描波數4000-12000cm-1，掃描次數為32次,解析度為8cm-1。

試驗方法

採集光譜前儀器預熱1h。採用滴管移取少量樣品於樣品管中， 將樣品管插入樣品台中的杯架中。先進行參比（空氣）掃描，參比掃描結束後，再掃描樣品。採用TQ Analyst8軟體進行數椐處理，以偏最小二乘（PLS）回歸算法建立模型，將樣品分為校正集和驗證集。採用校正集樣品建立校正模型並採用驗證集樣品進行驗證，最後根據校準決定係數、內部交叉驗證決定係數、預測決定係數、驗證均方差（RMSEC）、交叉驗證標準差（RMSECV）及預測標準差（RMSEP）等指標確定最優校正模型。

氣相色譜法

游離脂肪酸

取樣品，於100mL 離心管中，加入二氯甲烷－甲醇溶液( V/V = 2∶1)，0.0001g，然後勻漿、4000r /min 條件下離心5min; 取出離心管後，分別取下層溶液和上層溶液於具塞試管中，加入20%的0.88% KCl 溶液後混勻，過夜分層後取下層液體真空乾燥，所得物質即為粗脂肪。當得到總脂肪後，加入酮－甲醇溶液( v /v = 2∶1) 和Amberlyst－A26 陰離子交換樹脂於恆溫振盪器中震盪2h 後去除溶液，用丙酮－甲醇溶液洗5 次( 共用20mL) ，最後在通風櫥中用氮氣將交換樹脂吹乾後待甲酯化。

甲酯化

在圓底回流瓶中加入提取的油脂或吸附後的樹脂並加5mL 0.5mol /L 的氫氧化鈉甲醇溶液混勻後連線回流裝置。在100℃水浴中加熱回流5min，然後加3mL 三氟化硼－ 10% 甲醇溶液反應5min，最後加入2mL 正己烷回流萃取2min，取出冷凝裝置將回流瓶冷卻至室溫後加NaCl 飽和溶液混合，並將其移入具塞試管中，反覆沖洗回流瓶3 次將洗液一併倒入具塞試管中靜置。待分層後吸取上層溶液( 正己烷層) 約lmL 於樣品瓶中，於4℃下保存，以備氣相色譜儀分析。

GC 條件

氣相毛細管柱為Agilent SP－2560，100m × 0.25mm i.d × 0.2μm，柱初始溫度60℃，以8℃ /min 升溫至180℃，1.5℃ /min 升溫至240℃，保持3min; 氣化室溫度250℃; 載氣: N2; 柱流速:1mL /min; 分流比: 30∶1; 進樣量1μL。

數據分析

結果採用與標準品對照法定性及內標定量，並以平均值± 標準偏差( mean ± SD) ( n = 5) 的形式表示。數據採用SPSS 16.0 統計分析軟體進行數據分析，利用方差分析( One－Way ANOVA) 檢驗數值間的差異顯著性，當p < 0.05 時視為具有顯著性差異。

柱前衍生法

油脂水解產物中游離脂肪酸的檢測主要利用氣相色譜法, 但預處理步驟較為繁瑣, 需要通過改變水解產物pH 值或利用薄層色譜預先將游離脂肪酸分離。柱前衍生HPLC 法測定游離脂肪酸不需要分離游離脂肪酸的前處理, 且HPLC 檢測分離溫度較低, 脂肪酸熱降解程度大大降低, 具有氣相色譜法無可比擬的優越性而得到了廣泛的套用。目前, 利用柱前衍生HPLC 法測脂肪水解產物中游離脂肪酸的研究國外已有論文發表。

實驗儀器

Agilent -1100 型高效液相色譜、Zorbax SB -C18柱:美國安捷倫科技有限公司。

色譜條件

洗脫程式:初始流動相∶乙腈∶水(5∶95)經15 min梯度洗脫變化至100 %乙腈, 繼續洗脫17 min ;體積流量1 .6 m L/min ;柱溫:25 ℃;檢測波長254 nm ;進樣量20 μL , 利用外標法進行定量分析。

衍生化處理

準確稱取等量的2 , 4 -二溴苯乙酮和18 -冠-6醚配製成一定濃度的衍生化溶液, 置於4 ℃條件下避光保存;分別稱取肉豆蔻酸、硬脂酸、油酸和亞油酸0 .164 、0 .333 、0 .772 、0 .286 g , 以甲醇和二氯甲烷1∶1(v∶v)混合溶液定容至100 mL 待用。取上述脂肪酸標準溶液0 .15 mL 於具塞反應管中, 加入相應濃度的衍生化試劑3 mL , 另加入0 .4 g 碳酸鉀已形成pH值為8 .3 ～ 8 .5 的緩衝體系。混合物於80 ℃水浴中加熱30 min , 反應液置於4 ℃條件下冷卻1 h , 過0 .45 μm濾膜後, 待HPLC 分析。準確樣品0 .15 g , 以甲醇和二氯甲烷1∶1(v∶v)混合溶液定容至10 mL, 加入1 g 無水硫酸

鈉脫去酶解物中的水, 4 200 r/min 離心5 min , 取上清液0 .15 mL , 按上述中脂肪酸標準品衍生化步驟處理, 所得樣品待HPLC 分析。

統計分析

選用OriginPro 7 .5 軟體(OriginLab Corporation ,Northampton , USA)對數據進行單邊方差分析(ANOVA)。顯著性分析採用LSD 檢驗, 顯著性水平採用0.05 。