核轉錄因子SRF在胃癌中表達的生物學意義及其體外實驗研究

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目的：胃癌是常見的惡性腫瘤。其死亡率高，據統計2007年全世界累計報導了80萬例胃癌死亡病例。目前研究表明胃癌在男性癌症死亡率排第二位，而在女性排到第四位。胃癌診斷時多屬進展期胃癌，其預後差，多採用保守治療以延長生存率和保持生活質量。因此對胃癌的防治研究一直是癌症研究領域的熱點和重點課題之一。血清應答因子(serum response factor,SRF)是屬於MADS盒家族的轉錄因子。其功能性結合域血清應答元件(serum response elements，SRE)已經被發現在50個基因的啟動子上存在，包括立早基因(如c-fos和Egr-1)和肌肉組織相關特異基因。SPF通過對靶基因如立早基因和組織特異性基因的調節，能夠參與調控細胞增殖、分化和凋亡等多種細胞進程。近來研究顯示SRF在一些腫瘤，包括肝癌、甲狀腺癌、食管癌和肺癌的發生、發展和侵襲中起到重要的調節作用。有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase.MAPK)和RhoA信號通路是激活核內SRF表達的兩條重要信號轉導通路，能夠促進生長相關基因和細胞周期基因的轉錄。而且SRF在肌動蛋白骨架生物動力學方面也起到重要作用，參與對細胞遷移能力的調控。腫瘤細胞經常會出現細胞-細胞間以及細胞-基質間粘附的缺失，是腫瘤細胞侵襲周圍組織、侵犯血管導致惡性轉移的重要機制之一。E-鈣粘蛋白(cadherin)在細胞內E-連環蛋白(catenin)或β-catenin作用下，與肌動蛋白絲結合，參與調控細胞間粘附、遷移，在促進腫瘤侵襲和轉移中起到重要作用。E-cadherin、β-catenin複合物表達的改變與腫瘤的分化、侵襲和轉移密切相關。最近研究表明E-cadherin能通過Rac GTP酶，通過解離MAL和肌動蛋白(actin)，從而激活SRF的轉錄。然而，SRF在胃癌組織的表達，以及其對E-cadherin/β-catenin複合物調控作用仍未所知。本研究中，我們主要觀察1)胃癌組織中SRF、 E-cadherin和β-catenin的表達及其與臨床病理特徵的聯繫；2)RNA干擾技術基因沉默SRF對胃癌SGC-7901細胞增殖和侵襲的影響；3)ROCK通路阻斷劑Y-27632對胃癌SGC-7901細胞增殖和侵襲的影響及其可能的機制。方法： 1 採用免疫組織化學染色法檢測50例胃癌組織、50例手術切緣正常胃黏膜組織和29例淋巴結轉移灶中SRF、E-cadherin和β-catenin的表達，分析其與臨床病理參數的聯繫。 2 套用RNAi技術基因沉默SRF，觀察其對胃癌SGC-7901細胞增殖和侵襲的影響。設計併合成4條siRNA(SRF-900，SRF-901，SRF-1107和SRF-1649)。雷射共聚焦顯微鏡檢測轉染效率。採用realtime PCR篩選沉默效率最高的siRNA用於後續研究，採用免疫細胞化學染色和westem blot進行驗證。採用CCK-8法檢測細胞增殖，流式細胞儀檢測細胞周期， Vanswell小室檢測細胞侵襲能力。 3 ROCK通路阻斷劑Y-27632對胃癌SGC-7901細胞增殖和侵襲的影響。採用CCK-8法檢測細胞增殖，流式細胞儀檢測細胞周期，transwell小室和劃痕實驗檢測細胞侵襲能力和遷移能力。Western blot法檢測SRF、 E-cadherin和β-catenin、F-actin、MRTF-A及cyclin D1的表達。結果： 1 SRF、E-cadherin和β-catenin蛋白在胃癌組織中陽性(異位)表達率分別為52.0%、56.0%和68.0%，與對照組相比(16.0%、10.0%和18.%)，差異具有統計學意義。SRF在胃癌組織中陽性表達與侵襲深度和淋巴結轉移相關。E-cadherin和β-catenin蛋白異位表達與腫瘤的分化程度、浸潤深度和淋巴結轉移相關。SRF、E-cadhefin和β-catenin在淋巴結轉移灶中陽性表達率高於胃癌組，但僅有E-cadhefin在淋巴結轉移灶組與胃癌組比較差異具有統計學意義。 2 設計合成的4條針對SRF的siRNA(900、901、1107、1649)均能有效下調胃癌SGC-7901細胞SRF mRNA的表達，分別為空白對照組的56.4%、36.4%、25.0%和53.6%，差異具有統計學意義(p<0.05)。免疫細胞化學染色顯示SRF定位於細胞核，套用siRNA後SRF陽性染色顯著減少，western blot結果顯示轉染siRNA後SRF蛋白下調為空白對照組的40.1%，差異具有統計學意義(p<0.05)。與空白對照組、陰性對照組和轉染對照組相比，siRNA-1107轉染組細胞增殖明顯受抑，抑制率為64.24%，周期阻滯於G1期，侵襲細胞數為空白對照組的41.7%，差異具有統計學意義(p<0.05)。 3 套用siRNA能夠顯著下調MRTF、F-actin、SRF的表達，同時分別為空白對照組的50.9%、63.7%和36.9%，同時上調E-cadherin表達，是空白對照組的2.85倍，差異具有統計學意義(p<0.05)：對β-catenin和cyclin D1的表達也具有抑制作用，分別為空白對照組的61.0%和47.3%，差異具有統計學意義(p<0.05)。 4 套用Y-27632能夠顯著抑制胃癌SGC-7901細胞侵襲能力和遷移能力，但對細胞周期、細胞增殖無影響。Y-27632能夠顯著下調SGC-7901細胞中ROCK、F-actin、MRTF、SRF的表達，分別為空白對照組的37.0%、 44.3%、62.7%和62.7%，同時上調E-cadherin表達，是空白對照組的2.64倍，差異具有統計學意義(p<0.05)；而對核內β-catenin、cyclin D1表達無影響。結論： 1 SRF在胃癌組織中高表達，伴隨E-cadherin和β-catenin蛋白異位表達，並與浸潤深度、分化程度和淋巴結轉移相關，可能與腫瘤細胞粘附缺失獲得運動能力，侵襲能力增強有關。並為評估胃癌的惡性程度、診斷以及預後提供了新的生物學指標。 2 採用RNA干擾技術基因沉默SRF能夠顯著抑制胃癌SGC-7901細胞增殖和侵襲能力，同時伴隨上調E-cadherin的表達，和核內β-catenin表達的減少，提示SRF在胃癌細胞中可能參與調控細胞間粘附，以及促進wnt信號靶基因的轉錄作用，以此促進胃癌的發生、發展。SRF很可能是胃癌防治的一個重要靶點。 3 首次報導了ROCK通路阻斷劑Y-27632能夠抑制胃癌SGC-7901細胞侵襲和遷移能力，是通過上調E-cadherin表達，以及通過抑制MRTF-A的表達，最終抑制核轉錄因子SRF的轉錄。Y-27632這種作用提示ROCK信號轉導通路可能在胃癌的侵襲和轉移中起到重要作用，有可能成為胃癌治療的潛在靶點。

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